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IN VIVO STUDIES IN ANIMALS : PRECLINICAL PHARMACOLOGY

IN VIVO STUDIES IN ANIMALS : PRECLINICAL PHARMACOLOGY. An essential step between molecular and human studies for understanding the pathophysiological mechanisms involved in human diseases and the mechanisms of action of pharmacological agents. DEVELOPMENT OF EXPERIMENTAL MODELS

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IN VIVO STUDIES IN ANIMALS : PRECLINICAL PHARMACOLOGY

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Presentation Transcript

  1. IN VIVO STUDIES IN ANIMALS : PRECLINICAL PHARMACOLOGY An essential step between molecular and human studies for understanding the pathophysiological mechanisms involved in human diseases and the mechanisms of action of pharmacological agents.

  2. DEVELOPMENT OF EXPERIMENTAL MODELS OF CARDIAC AND RENAL DISEASES • Post-Ischemic Heart Failure (Coronary ligation) • (Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003; J. Cardiovasc. • Pharmacol., 2003; Richer et al., Circulation, Abstract, 2003) • Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury (reversible coronary oclusion) • (Richer et al., FASEB J, 2005) • Renovascular Hypertension (clip on renal artery) • Experimental Aldosterone-induced Cardiac Remodeling • Insulinoprive Diabetes (Streptozotocin) • (Huang et al., PNAS, 2003)

  3. ANIMAUX TRANSGENIQUES ET MALADIES CARDIOVASCULAIRES Ce sont des modèles avec une ou plusieurs modifications ciblées d’une hormone ou d’un second messager impliqués dans la régulation cardiovasculaire

  4. GENETICALLY MODIFIED ANIMALS Generation of genetically altered animals : - Models of gene inactivation : Tissue Kallikrein,ApoE. - Models of gene inactivation and duplication, genetic titration : ACE, Angiotensinogen,Tissue Kallikrein. Candidate genes : Vasoactive peptide systems, Ionic transporters. Breeding of mutated strains : - Importance ofgenetic backgrounds (Trabold et al., Hypertension, 2OO2) - Need of individual genotyping - Use of control littermates - Role of environmental factors : housing, diet.

  5. Souche Brown Norway résistante Absence d’AVC Souche Fischer 344 susceptible Développement d’AVC Effets variables du traitement au L-NAME selon les souches de rats Survie des rats Brown Norway (BN) et Fischer344 (F) après traitement au L-NAME. Pression artérielle des deux souches après traitement au L-NAME. BN 1 .8 .6 F Survival rate (%) .4 .2 0 0 10 20 30 50 60 70 80 90 40 Time (days)

  6. INVESTIGATED PARAMETERS • PHYSIOLOGICAL ANALYSES • Mortality • Invasive or non Invasive Cardiovascular Explorations • Blood pressure (invasive and non invasive : telemetry) • Cardiac function (invasive : Millar microcatheter transducer andnon invasive : 2D Echography, Acuson Sequoia 512) • Cardiac output, Regional blood flows (fluosphere technique) • Renal studies (metabolic cages) • Biochemical and hormonal studies (micromethods) • Morphological and morphometric studies • PHARMACOLOGICAL APPROACH • Agonists, Antagonists • Mechanisms of Action of Pharmacological Agents

  7. Insuffisance cardiaque • Incapacité du cœur à adapter le débit sanguin aux besoins métaboliques et fonctionnels des différents organes. • Véritable problème de santé publique dont la prévalence augmente régulièrement. • Cause la plus fréquente : insuffisance coronarienne responsable d’une dysfonction ventriculaire systolique. • Mécanismes adpatatifs : Précoces Retardés • système adrénergique • système rénine-angiotensine • système kallicréine-kinines • autres… • hypertrophie myocardique • fibrose interstitielle • dilatation des ventricules

  8. ANGIOTENSINOGENE Cathepsine G, Tonine, tPA. Rénine ANGIOTENSINE I (1-10) CAGE, Cathepsine G, Chymase. ECA Cathepsine A ECA2 Endopeptidases ANGIOTENSINE II (1-8) Prolylcarboxypeptidase ECA2 Aminopeptidase A ANGIOTENSINE (1-7) ANGIOTENSINE (1-9) ANGIOTENSINE III (2-8) ECA ECA Aminopeptidase M ANGIOTENSINE(1-5) ANGIOTENSINE IV (3-8) Voies de synthèse et de dégradation de l’AII. CAGE : chymostatin-sensitive angiotensin II generating enzyme ; ECA : enzyme de conversion de l’angiotensine ; tPA : tissue plasminogen activator.

  9. Méthodes (4) • Paramètres mesurés : • - Survie • - Hémodynamique : PAM, FC, PTDVG, débit cardiaque, débit rénal • - Fonction cardiaque : •  FE (échocardiographie bi-dimensionnelle, méthode « surface-longueur » monoplan) •  dP/dtmax • - Morphologie ventriculaire gauche : •  Taille d’infarctus •  Poids VG/poids total, poids VD/poids total •  Périmètre interne VG •  Masse VG/poids total •  Volume fin de diastole VG • - GMPc urinaire Analyse d’image Echocardiographie bi-dimensionnelle

  10. r = 0.56 p < 0.05 Ejection fraction (%) Shortening fraction (%) r = 0.54 60 80 25 30 35 40 45 50 p < 0.05 50 Infarct size (%) 60 40 3000 4000 5000 6000 7000 8000 30 40 20 20 SHAM MI 10 0 0 Comparisons of Invasive and non Invasive (echocardiography) Cardiac Explorations dP/dtmax (mmHg/s) Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003.

  11. 300 250 20 200 16 150 100 12 50 8 0 r = 0.90 r = 0.75 p < 0.001 p < 0.001 4 25 30 35 40 45 50 LV Diastolic Volume (mm3) LV perimeter (mm) 4 6 8 10 12 14 16 18 LV perimeter (mm) Infarct size (%) SHAM MI Correlations between Cardiac Morphological and Echocardiographic Parameters

  12. Irbesartan and survival in CHF in rats 100 80 P<0.01 60 P<0.001 % 40 Sham MI-Control 20 MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 Weeks

  13. Irbesartan and survival in CHF in rats 100 80 P<0.05 60 P<0.001 % Sham P=0.11 40 MI-Control MI-Irbesartan, 5 mg/kg/d 20 MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 Weeks

  14. 1. Up - regulation of the renin - angiotensin system (RAS) is a primary feature associated with chronic heart failure (CHF) in animal models and in humans. 2. Angiotensin I - converting enzyme inhibitors (ACEIs) prolong survival and prevent cardiac remodeling in the rat model of post- ischemic heart failure - (Pfeffer et al., 1985). ACEIs reduce morbidity and mortality and improve quality of life in patients with CHF and in patients who have had a myocardial infarction (Consensus, Solvd, Sa ve, Aire, Trace, etc...).

  15. 3. Angiotensin II AT receptor blockers (ARBs) also 1 prolong survival and prevent cardiac remodeling in the rat model of post - -ischemic heart failure. In patients with CHF, Losartan was effective at reducing mortality and morbidit y but its efficacy was not greater than that of Captopril (Elite II). .

  16. RATIONALE FOR ACEIs - ARB s COMBINATION IN CHF 1. ACEIs alone do not completely and permanently suppress Ang II production (reactive rise in renin, chymase). Addition of ARBs should result in a more complete inhibition of the RAS. 2. In hypertensi on, ACEIs and ARBs prove to be synergistic and , the g r e a t e r the RAS blockade achieved, the greater the antihypertensive effect.

  17. 10 80 0 60 -10 -20 mmHg mmHg 40 -30 * * -40 * # 20 -50 -60 0 0 5 10 15 20 valsartan 1 mg/kg/d vehicle benazeprilat 1 mg/kg/d + valsartan 1 mg/kg/d benazeprilat 1 mg/kg/d * # P <0.05 vs benazeprilat P <0.05 vs vehicle Valsartan - Benazeprilat combination in SHRs Absolute variations in MAP Pressor responses to Ang I (100 ng/kg) Webb et al., 1998

  18. Losartan - Enalapril combination in hypertensive patients Absolute variations in sitting DBP Absolute variations in active renin L E L+E * 50 0 * 40 -5 30 NS pg/ml mmHg 20 -10 10 0 -15 * NS L E L+E * Azizi et al., 2000

  19. SHAM RESULTS (1) : Survival 100 80 IS (%) 60 - % 44±1 MI-C P=0.006 40 P=0.03 MI-V 44±1 P=0.06 MI-E 43±1 20 MI-V+E 43±1 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Weeks

  20. SHAM MI-C MI-E RESULTS (2) : Cardiovascular parameters SAP LVEDP 200 30 * * * * 150 * * * 20 mmHg mmHg 100 10 50 0 0 dP/dt 15000 * * * 10000 P <0.05 vs SHAM * * mmHg/s MI-V 5000 MI-V+E 0

  21. * * * # # # SHAM MI-C MI-E MI-V+E RESULTS (3) : Cardiac remodeling HW/BW RVW/BW 1.0 4 * * * 3 * * mg/g mg/g 0.5 2 1 0.0 0 Subendocardial collagen 5 * * * * 4 * P <0.05 vs SHAM # 3 P <0.05 vs MI-V % MI-V 2 1 0

  22. SUMMARY In the rat model of post - ischemic heart failure : - Valsartan, Enalapril and their combination reduced mortality at 9 months by 39, 21 and 33%, respectively (NS), Valsartan, but not Enalapril and the combination, - limited the rise in LVEDP, Valsartan, but not Enalapril and the combination, - limited cardiac hypertrophy and fibrosis development. Valsartan like other ARBs, reduces mortality, and limits cardiac remodeling - AT1 receptor blockadeand ACE inhibition when combined do not exert synergistic effects -

  23. KININOGÈNE KININOGÈNE KININOGÈNE KININOGÈNE BPM BPM HPM HPM KALLICRÉINE KALLICRÉINE KALLICRÉINE KALLICRÉINE KININOGÈNE KININOGÈNE PLASMATIQUE PLASMATIQUE TISSULAIRE BPM HPM ECA ECA ECA Aminopeptidase N BRADYKININE BRADYKININE KALLIDINE KALLIDINE Fragments Fragments Fragments Fragments inactifs inactifs (Lys - BK) (BK) (BK) inactifs inactifs Carboxypeptidases Carboxypeptidases Carboxypeptidases Lys Lys - - des des - - Arg Arg - - BK BK Fragments Fragments 9 9 des des - - Arg Arg - - BK BK 9 9 inactifs inactifs ECA2 ECA2 RÉCEPTEUR B2 RÉCEPTEUR B1 RÉCEPTEUR B1 Constitutif Constitutif Constitutif inductible inductible inductible inductible

  24. Insuffisance cardiaque Kininogènes Angiotensinogène Rénine Kallicréine Angiotensine I Kinines IEC ECA IEC ECA Angiotensine II Fragments inactifs AT1- Récepteur AT1 Récepteur AT2 Récepteur B2 Récepteur B1 IP3, DAG, JAK, FAK, PI3K, MAPK NO, PGI2, EDHF Vasoconstriction, Effets trophiques, prolifératifs Vasodilatation, Effets anti-trophiques, anti-prolifératifs

  25. Bradykinine Angiotensine II • Vasoconstriction • Pro-arythmisante • Hypertrophie myocardique • Fibrose interstitielle •  stress oxydatif • Pro-inflammatoire • Pro-coagulante • Vasodilatation • Anti-arythmique • - Anti-hypertrophique • Antifibrotique • Anti-coagulante

  26. Le modèle d’insuffisance cardiaque post-ischémique peut être appliqué à des souris génétiquement modifiées pour étudier : • l’implication d’un ou plusieurs gènes dans le développement de la maladie, • le rôle de certains peptides dans le mécanisme d’action d’agents pharmacogiques utilisés dans le traitement de cette maladie.

  27. ACTIVITÉ DE LA KALLICRÉINE TISSULAIRE

  28. 10 mm 5 mm Ligature Circulation coronaire chez la souris: Oreillette gauche Oreillette droite Ligature Zone anévrismale Zone non infarcie Michael et al., 1995;269:H2150.

  29. p<0.05 vs valeur sham correspondante * Sham IM-Témoin Fonction cardiaque dP/dtmax FE 80 7000 70 6000 * * 60 5000 50 (mmHg/s) 4000 * * 40 (%) 3000 30 2000 20 1000 10 0 0 3 mois 6 mois 12 mois 6 mois 12 mois

  30. 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 p<0.05 vs valeur sham correspondante * Sham p<0.05 vs valeur 3 mois correspondante IM-Témoin † Hypertrophie myocardique Poids VG/Poids total Poids VD/Poids total * * * † (mg/g) (mg/g) * * † 3 mois 6 mois 12 mois 3 mois 6 mois 12 mois

  31. p<0.05 vs valeur sham correspondante * Sham IM-Témoin Dilatation ventriculaire gauche Périmètre interne VG GMPc urinaire 14 3.0 * * 12 * 2.5 10 * 2.0 8 (mm) 1.5 (nmol/µmol créat) 6 1.0 4 0.5 2 0 0.0 3 mois 6 mois 12 mois 6 mois

  32. Infarct size (%) Sham-TK+/+(n=18) MI-TK+/+(n=25) MI-TK+/+: 35±2 MI-TK-/-:34±2 Sham-TK-/-(n=19) MI-TK-/-(n=28) Survival 100 p<0.02 80 p<0.02 p<0.05 60 (%) 40 20 10 20 30 40 50 60 70 WEEKS Pons et al., Circulation, 2003,108: IV 152, Abstract

  33. MI-TK-/- vs MI-TK+/+ 80 80 60 60 * * 40 40 20 20 0 0 42 w p<0.05 vs corresponding Sham * Sham-TK-/- Sham-TK+/+ MI-TK+/+ MI-TK-/- LV function EF (%) EF (%) 4 w 12 w 42 w

  34. MI-TK-/- vs MI-TK+/+ † * † * 6 5 4 4 w 12 w 42 w 42 w 3 2 1 p<0.05 vs corresponding Sham p<0.05 vs corresponding TK+/+ 0 * † Sham-TK-/- Sham-TK+/+ MI-TK+/+ MI-TK-/- Cardiac remodeling: LV hypertrophy 6.0 5.5 LVM/BW (mg/g) 5.0 LVM/BW (mg/g) 4.5 4.0

  35. MI-TK-/- vs MI-TK+/+ † * * † 240 200 160 120 80 40 p<0.05 vs corresponding Sham p<0.05 vs corresponding TK+/+ 0 * † Sham-TK-/- Sham-TK+/+ MI-TK+/+ MI-TK-/- Cardiac remodeling: LV dilatation 220 200 180 160 LV diastolic volume (mm3) LV diastolic volume (mm3) 140 120 100 42 w 4 w 12 w 42 w

  36. Coupling between animal and human studies PHENOTYPING, EXPERIMENTAL PATHOLOGY, PHARMACOLOGY • Generation of pathogenic hypotheses, • Establishment of causality links between genes and diseases, • Development of therapeutic strategies

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