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Oferta del Servicio de Proteómica

Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid-CSIC. Oferta del Servicio de Proteómica. www2.cbm.uam.es/proteomica

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  1. Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-TofUNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIAAlberto Jorge GarcíaLaboratorio de ProteómicaCentro de Biología Molecular Severo OchoaUniversidad Autónoma de Madrid-CSIC

  2. Oferta del Servicio de Proteómica • www2.cbm.uam.es/proteomica • Análisis mediante Espectrometría de Masas • Identificación sistemática de proteínas presentes en las bases de datos a partir de geles • La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente

  3. Identificación Proteína BASE DE DATOS BASE DE DATOS Proteómica: Péptidos Proteoma Fragmentos Proteína Identificación Péptido

  4. Servicio de “Proteómica” • Digestión manual en gel • Análisis mediante MALDI-TOF: • Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) • Análisis mediante LC-ESI-IT • Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest • Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

  5. Requisitos para la preparación de geles • Reactivos • Manipulación • Frescos, alto grado de pureza. • Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio • Precauciones en la preparación de la muestra • Confección del gel • Lo más cercano posible a la entrega de la muestra • STD no preteñidos, no coloreados, no recombinantes. En cantidades conocidas y MW conocidos • No admitimos bandas ó spot recortados. Gel completo

  6. Requisitos para la preparación de geles • Diseño del gel (monodimensional). Usuario • Minimizar el tamaño del carril para mejorar la razón proteína:gel • Optimizar la resolución y enriquecer para muestras muy complejas • Geles 2 D (bidimensionales) • Incluido en la oferta de Servicio • Es crítica la preparación de la muestra por parte del usuario (Precipitación con acetona)

  7. Tinción de geles • Tinción Coomassie • Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco • Coomassie Coloidal, mayor contraste • No fijar con etanol, se forma acetato de etilo • Sensibilidad: 0.1 mg, Cuantitativo • Prácticamente nunca interfiere con la digestión • Tinción con plata (no recomendada) • Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa • Alta variedad en los protocolos de tinción • Interfiere con la digestión • Aumenta la necesidad de concentración de proteína, bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes

  8. Tinción de geles • Tinción fluorescente (mono ó 2 D) • Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata • Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO Orange, SYPRO Red, Deep Purple…) • No interfiere con la digestión • La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y recortar las bandas en un transiluminador UV (300 nm) • Disponible en el Servicio

  9. Digestión “in situ” de geles • Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con variaciones entre coomassie y plata. • Control interno de cada gel digiriendo std de pm (descarta problemas atribuibles a la preparación/tinción del gel) • Control externo con bandas/spots de geles ya procesados (descarta problemas atribuibles al proceso de digestión y preparación de muestra para MS)

  10. Servicio de “Proteómica” • Digestión manual en gel • Análisis mediante MALDI-TOF: • Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) • Análisis mediante LC-ESI-IT • Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest • Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

  11. Espectro de masas MALDI-TOF

  12. Resultados búsqueda en Mascot

  13. Asignación de péptidos en el mapa de MALDI

  14. Aspecto de un mapa cuando no hay digestión Las masas provienen de queratinas y autoproteolisis de tripsina

  15. Mapa típico de digestión de queratinas Contaminación por queratinas dentro del gel

  16. Sypro Rubi vs Plata STD PM Picomoles 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 Gel Sypro después de cortar Gel plata Gel Sypro

  17. Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa2 picomoles (88 ng) Sypro 17 péptidos Péptidos de Ovalbúmina T 8 péptidos Plata T T

  18. Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa500 fmoles (22ng) T Sypro 10 péptidos Péptidos de Ovalbúmina M T T Plata 2 péptidos T T T ?

  19. Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa250 fmoles (11 ng) 11 péptidos Sypro Péptidos de Ovalbúmina T T M T Plata T 3 péptidos M T T

  20. Identificación mediante PMF • Tres niveles de preparación de muestras: • Sensibilidad normal: método estándar en placa de acero inoxidable (automatizable) • Alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker (automatizable) • Muy alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (no automatizable)Siempre trabajamos con este método

  21. Identificación mediante PMF • Métodos de calibración: • Externa próxima, para búsquedas en DB con 100-150 ppm. Los espectros se adquieren con esta calibración • Mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm. Se aplica a la lista de masas obtenida por calibración externa • Interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm • Motores de búsqueda: • Internet (Mascot, Profound) * Campillo, Martín and Vázquez

  22. Identificación mediante PMF Causas por las que no se identifica una proteína • Mapa con un nº insuficiente de péptidos • Mezcla de proteínas • Proteína no presente en DB • Alto nivel de contaminación • Modo en el que se genera la lista de masas

  23. Servicio de “Proteómica” • Digestión manual en gel • Análisis mediante MALDI-TOF: • Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) • Análisis mediante LC-ESI-IT • Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest • Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

  24. Identificación de péptidos presentes en DB mediante LC-MS/MS ESI-IT • Alta sensibilidad en modo “full scan”: Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un digerido en solución de estándar de BSA • Muy alta sensibilidad en modo SIM: “Monitorización de iones sencillos”, 1-10 fmoles para estándar de BSA

  25. Exclusión Dinámica (Triple-play)

  26. 736.3 736.3 655.2 100 100 100 A B C 90 90 90 80 80 80 736.7 70 70 70 655.6 z = +2 M = 1470.6 z = +2 M = 1308.4 60 60 60 Intensidad Relativa 50 50 50 40 40 40 656.2 30 30 30 737.2 655.3 20 20 20 10 10 10 817.3 1082.7 0 0 0 600 700 800 900 1000 1100 1200 735 736 737 738 739 654 655 656 657 658 m/z m/z m/z 704.5 100 D MFVGGLSWDTSKK 90 80 70 D W S L G G V F M 60 Intensidad Relativa 50 1078.3 40 30 851.3 394.3 20 1177.3 295.2 1021.3 10 463.5 764.3 589.5 964.3 1325.0 0 400 600 800 1000 1200 1400 m/z MF V 656.1 100 E YDVYLINPQGK 80 60 Q P N I L Y V DY Intensidad Relativa 543.2 40 767.1 769.2 20 429.1 932.2 541.0 881.2 378.0 279.0 204.0 333.1 1106.1 1031.1 0 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 YD V Y L I N PQ m/z Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos

  27. Análisis mediante Espectrometría de Masas • Análisis empleando MALDI-TOF • Muestras preparadas por usuario (incluye portas y matriz) • Muestras preparadas por el Servicio • Análisis empleando LC-ESI-IT de fracciones de péptidos provenientes de HPLC preparadas por usuario

  28. Equipos disponibles • Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex de Bruker, equipado con reflector • Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100 con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04 por un año) • Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT y columna RP de 180 mm, flujos de 1,5 a 2 ml/m

  29. Procedimiento de trabajo • Recepción y control de muestras • Aviso previo a la entrega de geles • Escaneo del gel, • Confección de ficha de usuario, • Instrucciones del trabajo a realizar • Análisis • Digestión manual en gel • Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-TOF • Análisis mediante LC-ESI-IT

  30. Personal del Servicio de Proteómica • Rosana Rogado: • Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de Investigación y Laboratorio • Alberto Jorge: • Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y Laboratorio • Yolanda Núñez: • Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio • Anabel Marina: • Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2

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