Heparan Sulfate Proteoglycans as Regulators of Fibroblast Growth

1. Heparan Sulfate Proteoglycans as Regulators of Fibroblast Growth Factor-2 Signaling in Brain Endothelial Cells SPECIFIC ROLE FOR GLYPICAN-1 IN GLIOMA ANGIOGENESIS* Dianhua Qiao, Kristy Meyer, Christoph Mundhenke‡, Sally A. Drew, and Andreas Friedl§ THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 18, Issue of May 2, pp. 16045–16053, 2003

2. Abreviaciones utilizadas: FGF2, fibroblast growth factor-2; FGFR, fibroblast growth factor receptor; HS, heparan sulfate; HSPG,heparan sulfate proteoglycan; vWF, von Willebrand factor; MBE,mouse brain endothelial; HMVEC, human microvascular endothelialcell; BrdUrd, bromodeoxyuridine; AP, alkaline phosphatase; VEGF,vascular endothelial growth factor.

3. FIG.1.Requerimiento de HS para la senalización de FGF2 en cells endoteliales. Cloruro 24 hs sin suero Sulfato Incorporac. BrdU Ensayo colorimetrico FGF-2 Heparina BrdU Cells murinas sin Cloruro 24 hs sin suero Sulfato FGF-2 Heparina Sonicado Cells bovinas sin Plasminógeno + Sustrato cromogénico Medición Absorbancia

5. Fig.2A.Medición expresión HPGs en diferentes tipos de cells endoteliales Extracción de HSPGs Tratamiento enzimático(Condroitinasa y Heparitinasa) para remover glucosaminoglicanos(GAGs) Análisis en gel SDS-gradiente de poliacrilamida 3%-15% Revelado Ab-anti proteínas Core (calles 5-9) Revelado Ab-anti HS (calles 1-4)

6. Aislan HSPGs de cells MBE Biotina Fig.2B. Función de HSPGs como co-estimuladores de FGF-2 HSPGs Sobrenadante Eluido (NaCl 2M) Concentración en bolitas DEAE SDS-PAGE Revelado con Ab-anti HS

7. Fig. 2C. HSPGs promueven la unión de FGF-2 a FGFR1 Gel Gradiente (3-15% ) HSPGs(MBE) + FGFR1-Agarosa + FGF2 Lavado c/NaCl (0.6-1-1.4 M) Revelado Ab-anti HS Controles (-) • Digestión HSPGs con • heparitinasa previo a • la formación del complejo • (linea 2) • Omisión de FGF-2 • (linea 3)

8. FIG.3. Actividad de diferentes HSPGs de cells endoteliales de cerebro como promotores de señalización por FGF2. Cell Associated (Lisado de cells) LISIS 72 hs Extracción con buffer Lavados Cells MBE MEC Columna DEAE (enriquecimiento de HSPGs) Extracción selectiva de HSPGs Hep´asa Dot blotting (cuantificación con Ab 3G10) Fig 3A Fig 3B

9. Ab AP Ab 2rio ( ) FIG.4. Reconstitución in situ del complejo FGF2-HSPG-FGFR1. Lavados FR1-AP Tejido

10. FIG.5. Detección inmunohistoquimca de los core protéicos de HSPG en cortes parafinados.

11. FIG.6.Detección de core protéicos de HSPG en tejidos humanos de glioma y cerebro normal por inmunofluorescencia.

12. Fig.7. Sobreexpresión de Glipican-1 promueve crecimiento y sensibiliza la estimulación de cells endoteliales por FGF-2 Transfección con Glipican-1 Medición incorporación BrdU + FGF-2 Cells MBE Transfección Mock Extracción HSPGs Extracción HSPGs SDS-PAGE Revelado Ab-anti HS

13. Conclusiones • Para que FGF2 estimule la proliferación de cells endoteliales es necesario la presencia de HS (Fig.1) • Las HSPGs de superficie de membrana predominantes son Sindecan-2 y -4 de las cells endoteliales examinadas, mientras que Sindecan-1 y –3 y Glipican-1 representan una fracción menor de HSPGs en algunos tipos cells, e indetectables en otros (Fig.2A). • Todos los core proteicos de los HSPGs analizados poseen cadenas de HS a las cuales se pega FGF2. Éstas, promueven la unión de FGF2 al receptor FGFR1c (Fig.2B y 2C). • Los HSPGs son capaces de formar un complejo que es funcional (capaz de desencadenar una señal) en experimentos in vitro (Fig.3). • Existe una alteración cualitativa o cuantitativa de los HSPGs en los vasos de glioma, evidenciado por la reconstitución in situ del complejo ternario (Fig.4). • El contenido total de HSPG en vasos de glioma se haya incrementado respecto de vasos normales • (Fig. 5A/B), siendo Glipican-1 el de mayor sobreexpresión en tejidos tumorales (Fig.5 E/F). • Cortes de glioma y tejidos normales revelaron por inmunofluorescencia la sobreexpresión de Glipican-1 y su co-localización en cells endoteliales (Fig.6). • Los resultados sugieren un rol específico de Glipican-1 en el crecimiento endotelial y de la mitogénesis inducida por FGF2 en procesos angiogénicos. El aumento en la síntesis de Glipican-1 en cells endoteliales permitiría una sensibilidad local mayor al factor de crecimiento, llevando a la reconstitución del tejido dañado en procesos normales, mientras que el mismo mecanismo favorecería la radiación de tejidos tumorales.