Les mécanismes de la vulnérabilité à la chaleur : implication des stress systémique et cellulaire

1. Les mécanismes de la vulnérabilité à la chaleur : implication des stress systémique et cellulaire Présentation de thèse Virginie Michel Pôle de neurophysiologie du stress Département des facteurs humains Centre de Recherches du Service de Santé des Armées

2. Plan PLAN • Rappels bibliographiques: • Le coup de chaleur • Le stress • Le stress systémique • Le stress cellulaire • Relations stress et chaleur • Travail expérimental • Objectifs • Pré-requis expérimentaux • Expérimentation 1 • Expérimentation 2 • Discussion générale • Synthèse des résultats et perspectives

3. Rappels bibliographiques

4. Le coup de chaleur (CC) Le coup de chaleur (CC) • Pathologie grave avec une létalité de 10 à 50% • CC d’exercice vs CC classique • Signes cliniques: • Hyperthermie et déshydratation • Symptômes neurologiques (de la confusion au coma) • État de choc cardio-vasculaire • Inflammation systémique (forme d’entrée dans le SRIS) • Défaillance polyviscérale • Séquelles: • Lésions du SNC (Syndrome cérébelleux, parkinsonien…) • Absence de traitement étiologique

5. Le coup de chaleur (CC) • Facteurs de risque : • Exercice long et intense • Environnement chaud et humide • Déficit en sommeil et fatigue • Infections virales CCE • Tares cardio-vasculaires, respiratoires, métaboliques, neurologiques ou psychiatriques • Médicaments (psychotropes, alcool, diurétiques…) • Nouveau-nés et personnes âgées CCC • Mauvaise compréhension de la physiopathologie

6. Modèle animal de CC • Modèle “animal anesthésié” exposé au chaud • Mauvaise reproduction de l’évolution de la pathologie humaine • Compréhension des mécanismes d’émergence du CC • Poly-instrumentation

7. Mécanismes du CC , NO

8. Modèle vigile de CC coma † ascension finale choc cardio-vasculaire plateau de thermorégulation ascension initiale 43 Tco(°C) 41 dérégulation thermique 39 mécanismes de dérégulation 37 Temps Ta ­ 22°C HR ­ 50% Ta ­ 40°C HR ­ 50% • Modèle “animal vigile” • Moins d’instrumentation • Bonne reproduction de la pathologie humaine • Evolution de température corporelle (Tco) • Enchaînement des symptômes

9. Hétérogénéité • Différences de cinétique d’évolution de Tco à la chaleur • qui expliquent l’hétérogénéité du risque • Chez l’homme stress • Faible prédictibilité du CC Wright, 1977 • L’hétérogénéité du risque de CC • Chez l’animal

10. Définition du stress État de stress dépassé Coût biologique Selye, 1946 • Définition du stress • Réaction biologique aspécifique d’un organisme confronté à un agent agresseur (stresseur) • Réaction triphasique • Syndrome général d’adaptation

11. L’hypothèse allostasique maintien bonne santé Si réponse efficace Maintien d’un bas niveau de Tco Tolérance à la chaleur lutter à moindre coût, donc durer plus longtemps mécanismes de transition ? Si réponse inefficace apparition maladie état physiologique état pathologique lutter à fort coût, donc durer moins longtemps Coup de chaleur • Intégration temporelle : l’hypothèse allostasique • Charge allostasique : • Coût biologique induit par la réponse de l’organisme face à une agression • Variabilité inter-individuelle directement liée au coût biologique par unité de temps

12. Niveaux allostasiques • Le stress : • Assurer un fonctionnement hors homéostasie au prix d’une charge allostasique • Au niveau de l’organisme • Au niveau de la cellule • Médiateurs du stress • Stress systémique • Deux médiateurs • Axe sympathique • Axe corticotrope • Stress cellulaire • Heat Shock Proteins (Hsp)

13. Axe corticotrope CRF POMC Clivée en ACTH Corticostérone Yehuda, 2002 • Axe corticotrope - Chaîne d’amplification + produit final : corticostérone • - Rôles de la corticostérone • + mobilisation énergie • + anti-inflammatoire • + rétrocontrôle inhibiteur • axe corticotrope • SNC - Mécanismes d’action + 2 récepteurs GR & MR

14. Heat Shock Proteins métaux lourds Stimulation hormonale Stress psychologique radicaux libres inflammation Protéines dénaturées chaleur • Les Heat shock proteins (Hsp) • Hsp70 = forme inductible majeure • Rôles des Hsp70: • Chaperons moléculaires • Lors du stress: • Survie cellulaire • Chaperons protéiques Santoro, 2000 • Coût de synthèse des Hsp

15. Relation stress/chaleur † † plateau de ascension ascension thermorégulation initiale (°C) finale 43 Tco (°C) re T 41 39 37 Temps réaction phase de résistance phase d’épuisement d’alarme • Relations stress et chaleur • Analogie du décours temporel de la Tco à la chaleur et de la résistance de l’organisme face à un stresseur • Coup de chaleur : état de stress dépassé, épuisement

16. Définition tolérance = = stress agresseur - Réaction de l’organismeface àla chaleur Intolérance à la chaleur Tolérance à la chaleur Wright, 1977

17. Implication médiateurs du stress au chaud Heatshock (45°C) Lin et al, 2000 Li et al, 2001 • Glucocorticoïdes • Sécrétion rapide (10 min) et prolongée à la chaleur • Action protectrice • surrénalectomievsTémoin • Hsp70 • Action protectrice • pré-inductionvsTémoin • Production à la chaleur • Ascension rapide des ARNm (35 min) • et plus tardive des protéines (4 h) • Homme : CC sévère avec anti-corps anti Hsp

18. Travail expérimental

19. Objectif de thèse • Objectif de thèse • Déterminer le lien entre tolérance à la chaleur et stress • Questions expérimentales • Quel rôle jouent les 2 médiateurs du stress dans la tolérance à la chaleur ? Existe-t-il une interaction entre ces 2 médiateurs ? • Quelle relation existe-t-il entre tolérance à la chaleur et qualité du stress ?

20. Conditions d’exposition • Conditions d’exposition à la chaleur (vigile) 2 modèles expérimentaux, 2 types de contraintes Stress par mesure de Tco par thermocouple Déplétion pharmacologique en glucocorticoïdes Plusieurs groupes à des durées d’exposition croissantes: 0-60 min, Ta=40°C Expérimentation 1: état stressé avec/sans glucocorticoïdes avant exposition Absence de stress par mesure en télémétrie Conditions expérimentales similaires pour tous les animaux: 90 min, Ta=40°C Hétérogénéité naturelle Expérimentation 2: Variabilité inter-individuelle

21. Critères de jugement d’intolérance • Critères de jugement d’intolérance • Critère de risque létal : • Sévérité hyperthermie, représentée par la charge thermique ou AUC40,4 (aire sous la courbe de Tco au delà de 40,4 de Tco) • Si AUC40,4 > 20°C.min risque létal dans les 24 h qui suivent l’exposition à la chaleur (Hubbard et coll, 1977) • Critères de l’émergence pathologique : • Tco et AUC40,4 élevées • Déshydratation (hématocrite, protéines plasmatiques) • Altérations métaboliques (lactatémie) • Syndrome inflammatoire (ARNm IL-1β, TNF- et IB) • Activation cérébrale (gènes précoces, ARNm c-fos) • Comportement aberrant (activité motrice spontanée)

22. Critères de jugement du niveau de stress • Critères de jugement du niveau de stress • Axe corticotrope • Concentrations de glucocorticoïdes et ACTH dans le sang • Expression des ARNm dans les structures hypothalamique (CRF) et hypophysaire (POMC) • Axe sympathique • Variables indirectes : lipolyse stimulée par les récepteurs ß3 • Accumulation sérique de glycérol, et triglycérides • Stress cellulaire • Expression des ARNm Hsp70 dans différentes structures cérébrales

23. Expérimentation 1 Expérimentation 1: Quel rôle jouent les 2 médiateurs du stress dans la tolérance à la chaleur ? V. Michel, A. Peinnequin, A. Alonso, A. Buguet, R. Cespuglio, F. Canini, Effect of glucocorticoid depletion on heat-induced Hsp70, IL-1β and TNF-α gene expression, Brain Research (2007)

24. Hypothèses • Hypothèses: • Les animaux les moins tolérants sont ceux ayant le moins d’ARNm Hsp70 • Une déplétion de glucocorticoïdes rend les animaux plus vulnérables à la chaleur • Objectifs: • Évaluer la cinétique d’apparition des ARNm Hsp70 à la chaleur et leur relation avec le risque létal • Évaluer l’effet de la déplétion des glucocorticoïdes sur: • la tolérance à la chaleur • l’expression des ARNm Hsp70

25. Pré-expérimentation • Validation des conditions expérimentales: • Déplétion pharmacologique des glucocorticoïdes par la métyrapone (inhibiteur de la synthèse des glucocorticoïdes) • Durée d’exposition à la chaleur • Délai de réaction ARNm Hsp70 • Principaux résultats: • La métyrapone bloque l’augmentation de glucocorticoïdes • Induction majeure ARNm Hsp70 avant la 1ère heure d’exposition • Absence d’effet de la déplétion de glucocorticoïdes • sur la tolérance à la chaleur et l’expression des ARNm Hsp70 • Effet hypothermiant de la métyrapone • Élimination hypothermie en plaçant les animaux à Ta=29°C

26. Protocole 9h00 10h45 9h45 10h30 8h00 10h00 9h30 7h00 10h15 Habituation de cage Réf Sacrifice H0 expo 15 min Sacrifice H15 expo 30 min Sacrifice H30 Injection sc Thermocouple Sacrifice H45 expo 45 min Ta = 29°C pour animaux métyrapone expo 60 min Sacrifice H60 Sacrifice Témoin injection Sacrifice Témoin • Protocole: • 2 groupes de traitement : • métyrapone (150 mg.kg-1 sc) et vecteur : PEG • 7 groupes de conditions • Témoins, Témoins injection, exposés au chaud (H0 à H60)

27. Expression ARNm Hsp70 (1) ARNm Tco (°C) • Expression des ARNm Hsp70 selon Tco finale (cortex frontal) • Chez les animaux PEG: • Expression exponentielle • - Pas d’effet de la métyrapone sur l’expression d’Hsp70

28. Groupes de charge thermique • Classification a posteriori selon l’AUC40,4 : Etat clinique : - Déshydratation - Métabolisme - Inflammation °C.min AUC Control 40,4 35 PEG Metyrapone 30 25 Seuil risque létal 20 15 10 5 0 Control HL1 HL2 HL3 Injection + H0 Témoins H15 + H30 + H45 + H60

29. Expression ARNm Hsp70 (2) 10 AUC < 20 HL2 9 HL3 AUC > 20 8 7 6 5 Hsp70 (AU) 4 3 ARNm 2 1 0 0 10 20 30 40 50 AUC °C.min 40.4 Faibles charges thermiques AUC < 20°C.min Principal stimulus d’induction Hsp70 : chaleur Corrélation ARNm Hsp70/charge thermique Fortes charges thermiques AUC >20°C.min Absence de corrélation ARNm Hsp70/charge thermique Autres facteurs impliqués dans l’induction Hsp70 • Expression des ARNm Hsp70 selon le risque létal

30. Etat clinique ** °°° + PEG : déshydratation  * °°°  + PEG déséquilibre métabolique • Etat clinique + Métyrapone : déshydratation moindre + Métyrapone

31. Inflammation (cortex) + PEG • ARNm IL-1 + PEG : pas d’effet  °° + Métyrapone *  + Métyrapone :  ARNm TNF-

32. Hypothèse 1 = marqueur de l’agression cellulaire • Hypothèse 1: • Réfutée : risque létal expression ARNm Hsp70 élevée • Induction ARNm Hsp70 en relation avec tolérance au chaud • Facteurs impliqués dans l’induction des Hsp70: • Sans risque létal : chaleur • Avec risque létal : chaleur + autres facteurs (déséquilibre métabolique, inflammation) • radicaux libres, dénaturation des protéines ?

33. Hypothèse 2 Glucocorticoïdes bénéfiques pour le cerveau • Hypothèse 2: • Déplétion de glucocorticoïdes pas d’effet sur réponses physiologiques et expression des ARNm Hsp70 • Pourrait accroître la vulnérabilité à la chaleur par l’  de l’expression des ARNm TNF-α

34. Perspectives Vulnérabilité à la chaleur accrue Déplétion glucocorticoïdes associée à sous-entend que la réactivité axe corticotrope jouerait un rôle dans la tolérance à la chaleur implique une analyse de cette réactivité sans blocage pharmacologique, ni contrainte, afin de faire ressortir la variabilité inter-individuelle en pratique animaux exposés en libre cours sans autre contrainte à 40°C pendant 90 min (exposition identique et calibrée)

35. Expérimentation 2: • Quelle relation existe-t-il entre tolérance à la chaleur et stress ? V. Michel, A. Peinnequin, A. Alonso, A. Buguet, R. Cespuglio, F. Canini, Decreased heat tolerance is associated with hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis impairment, Neuroscience (2007)

36. Hypothèse • Hypothèse: • L’intolérance à la chaleur est associée à un stress inadéquat en terme d’activation corticotrope • Objectifs: • Déterminer la relation entre tolérance à la chaleur et l’activation de l’axe corticotrope • Chez l’animal naïf en jouant sur la variabilité inter-individuelle • Mimer la réalité clinique de l’exposition à la chaleur (rat vigile) • Déterminer le tableau clinique d’une intolérance au chaud (Ta=40°C, 90 min) • Déterminer les critères prédictifs d’une intolérance à la chaleur

37. Protocole (1) • Télémétrie • Mesure télémétrique de Température abdominale (Tabd) • Activité motrice spontanée (SA) • - En continu tout au long de l’expérimentation • - Animaux non contraints

38. Protocole (2) • Protocole Sacrifice 42,4°C 0,1 10 jours 90 min Intolérant n=14 Période de récupération Exposition à 40°C Classification a posteriori n=68 41,4°C 0,0 Médian n=24 Exposition à 22°C n=80 n=12 40,7°C 0,1 Tolérant (témoins) n=30 selon la Tabd finale* Implantation capteur télémétrique 36,9°C 0,2 Témoin n=12 * Analyse en k-mean permettant de minimiser les écarts intra-groupes et de maximiser les écarts inter-groupes

39. Protocole (2) Etat clinique Etat d’activation de l’axe corticotrope Etat d’activation et d’agression cellulaire Etat inflammatoire

40. État clinique +++ *** +++ *** *** *** *** *** +++ *** ** • Etat clinique • Déshydratation Protéinémie Hématocrite • Déséquilibre métabolique • Lactatémie Glycémie

41. Statut de stress (1) * * *** *** +++ *** • Lipolyse Glycérolémie Triglycéridémie

42. Statut de stress (2) § § *** *** *** *** +++ *** § • Axe corticotrope • Corticostéronémie ACTH plasmatique

43. Activation et agression +++ +++ *** *** *** *** ** ** • État d’activation et d’agression de l’hypothalamus • Les cellules hypophysaires et hypothalamiques • Rendement fonctionnel faible (POMC et CRF) • Contrainte métabolique • L’agression thermique • Forte activation (c-fos) • Production de défense (Hsp70)

44. Inflammation (1) *** +++ *** * +++ TNF- +++ *** IB § ** *** activation transcription cytokines pro-inflammatoires NF-B • Etat inflammatoire de l’hypothalamus IL-1ß

45. Inflammation (2) glucocorticoïdes IB activation transcription activation transcription cytokines pro-inflammatoires NF-B TNF-, IL-1… - Hypothèses mécaniciste: Les glucocorticoïdes sont responsables de l’inhibition du TNF- et de l’activation d’IB  effet inhibiteur des gluco sur inflammation, ARNm IL-1β et TNF-(Barnes, 1998 et 2006) rôle protecteur effet activateur des gluco sur l’expression des ARNm IB(Scheinman et coll, 1995)  rôle protecteur

46. Conclusion † † plateau de ascension ascension thermorégulation initiale finale (°C) 43 Tco (°C) re T 41 39 37 Temps réaction phase de résistance phase d’épuisement d’alarme État de stress dépassé Intolérant Médian Tolérant • Charge allostasique • Tol : charge faible • Intol : charge élevée

47. Prédictibilité (1) *** *** *** *** * • Prédictibilité physiologique du risque

48. Prédictibilité (2) *** *** § * • Prédictibilité comportementale du risque • Facteurs de prédictibilité synchroniques : • - Physiologie • - Comportement

49. Discussion générale et perspectives

50. Cohérence durées d’exposition croissantes utilisation variabilité inter-individuelle versus modulation pharmacologique variabilité inter-individuelle animaux pré-stressés animaux paisibles • Forte cohérence des 2 modèles expérimentaux Expérimentation 2 Expérimentation 1 HL3 Intolérant déshydratation  lactatémie élevée  activation inflammatoire cérébrale (ARNm IL-1β)  forte agression cellulaire (ARNm Hsp70) Tableau clinique cohérent de l’intolérance à la chaleur