1 / 72

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK. RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK. 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restri kciós endunuklázának felfedezése. H árom fő csoport. I típus

chad
Download Presentation

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdeteA Haemophilus influenzaerestrikciós endunuklázának felfedezése Három fő csoport • I típus • Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en(~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja,nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén.Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához • Pl.EcoK. • Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

  2. A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK • II típus • Speciáliscélszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon • a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében • pl. EcoRI • Mg2+kell • Ez a típus az elterjedt • III. típus • I és II.Kombinációja. Mindkét DNSszálat hasítja • egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától • plHgaI • Mg2+-t ésATP-t igényel

  3. 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3' 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5' 5' GG CC 3' 3' CC GG 5' A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Forrás organizmus Enzim Felismerőhely hossza Felismerő-hasítóhely AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Ragadós végeket adó hasítások (sticky end) 5' túlnyúló Sal I 6 Streptomyces albis 3' túlnyúló Kpn I 6 Klebsiela pneumonia Tompa végű hasítások (blunt end) Hae III 4 Haemophilus aegyptus

  4. Palindrom példák KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK

  5. Isoschisomers AtcI 6 5' GGTAC/C 3' KpnI 5' GGTAC/C 3' XmaI 6 5' C/CCGGG 3' SmaI 5' CCC/GGG 3' Kompatibilis véget adó enzimek SalI 6 5' G/TCGAC 3' XhoI 5' C/TCGAG 3' FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK AflIII 6 5' A/CPuPyGT 3' BspHI 6 5' T/CATGA 3' NcoI 6 5' C/CATGG 3' NdeI 6 5' CA/TATG 3'

  6. adenin DNS METILÁZOK - dam metiláz (dezoxiadenin metiláz) 5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén - dam- törzs használata - nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

  7. dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) • 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek - megoldás ugyanaz, mint a dam esetén citozin Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz

  8. Polimerázok • DNS függő DNS polimerázok • RNS függő DNS polimerázok • Templátfüggetlen DNS polimeráz • DNS függő RNS polimeráz • 5’  3’ polimeráz aktivitás

  9. DNS függő DNS polimerázok

  10. DNS jelölés, nick transzláció

  11. Templát független DNS polimeráz

  12. RNS függő DNS polimeráz

  13. A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

  14. DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS denaturáló nem-denaturáló lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) Nincs roncsoló ágens méret > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp Mátrix agaróz agaróz 0.5- 2% poliakrilamid technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos LÁTHATÓVÁ TÉTEL: etídium bromid, interkaláló festék Þ nem-denturáló körülmények, elsőősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is. A DNS 254 nm-en elnyel Þ energia a festékre Þ 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülményközött radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók .

  15. Horizontális gélelektroforézis

  16. DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL - közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t - a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével AGARÓZ • dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis • a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos • kicsapással, univerzális, széles mérettartomány - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-onmegfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális - • kromatográfiás módszerek • 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagélfelületére kötődik, • a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány • DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, • innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható • nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén • jó a kitermelés POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

  17. Klónozás fogalma Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert B A ligálás B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

  18. Bacterium Cell containing geneof interest Gene of interest Plasmid Bacterialchromosome DNA ofchromosome RecombinantDNA (plasmid) Recombinatebacterium 3 Gene of interest Protein expressedby gene of interest Copies of gene Protein harvested Basic research on protein Basic research on gene Gene used to alterbacteria for cleaningup toxic waste Human growth hormone treatsstunted growth Gene for pestresistance inserted into plants Protein dissolvesblood clots in heartattack therapy Figure 20.2

  19. rezisztencia marker replikációs origo ORI KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT VEKTORTÍPUSOK inszert méret példa plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kb fonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kb fagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb l fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kb kozmidok pHC79 néhányszor 10 kb néhány 100 kb BAC, YAC pBAC108L, pYAC3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome PLAZMIDOK Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

  20. Egy ősi plazmid: pBR322

  21. Magas kópiaszámú változat: pUC19

  22. Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása • antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges • kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható • plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos • polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus • gyors ha nincs más szelekció • kék fehér színszelekció, • pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént  megszűnik a letalitás • auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

  23. Kolónia hibridizáció

  24. LacZ a komplementáció F' plazmidon: defektív b- galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót és az 1-146 aminosavat a kettő együtt: aktív b – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el  X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment  X-gal szubsztráttal fehér telep

  25. PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI 1. Kémiai transzformálás Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfalpermeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre : normál érték: 106 – 108 nagyon jó: 109 • a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: • oldatok edények tisztasága, • - sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete • hősokk hőmérséklete hossza • permeabilizáló faktor a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé • egyéb fogások: • spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezttranszformáljuk • - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

  26. Elektroporáció A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású  600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása

  27. cos cos bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb a középső, centrális régió eltávolítható EcoRI BamHI SalI EcoRI BamHI SalI A  fágok általános felépítése  genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS  fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság  két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak  a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek

  28. Speciális λ fág fajták

  29. Mesterséges kromoszómák: BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

  30. Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

  31. KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI - genomiális a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból - cDNS az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból expressziós a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns

  32. GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA hasító helyek jobb kar bal kar centrális régió emésztés részleges vagy 20-24 kb méretű teljes emésztés fragmentek bal kar jobb kar ligálás konkatamer in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

  33. cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

  34. cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

  35. RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL - nem tudunk semmit - ismeretek a fehérje funkciójáról csak fenotípus alapján jellemezhető mutagenezis (transzpozon) kromoszomális séta • van tisztított fehérje • fehérje funkció tesztelhető • expressziós könyvtárak • fehérje szekvenálás • DNS próba tervezés • ellenanyag termeltetés • expressziós könyvtárak már van ilyen fehérje illetve gén más típusú sejtekből heterológ próba használata könyvtárak átvizsgálásához EGYÉB pl. ha a fehérje szabályozása ismert  szubsztraktív hibridizáció - számítógép, adatbankok genom szekvenálások

  36. A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek: 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA 3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA

  37. RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS

  38. B A Klónozás, szubklónozás A B C A vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert ligálás B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás

  39. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA

  40. FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK PROKARIÓTÁK E.coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E.coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK • emlős sejtvonalak • minden fajta fehérje termeltethető bennük • tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek, • stabil expressziós rendszerek • hosszú, fáradságos optimalizálást igényel • élesztő • gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, • sok ismeretanyag • viszonylag könnyű kezelhetőség • poszttranszlációs modifikációk lehetősége

  41. TSZE PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI SZF GS  Pr -35 -10 SD kódoló szekvencia TT STOP kodon UAAU UGA UAG -10 -35 TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

  42. cDNS-ből készült expressziós könyvtárból -Immunológiai detektáláspoli- vagy monoklonális ellenanyaggal   -Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben)   -Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének)

  43. Polimeráz láncreakció I. Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

  44. Polimeráz láncreakció II.

  45. A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I. - FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket  speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

  46. DdeI DdeI DdeI DdeI Normal  -globin allele 201 bp Large fragment 175 bp Sickle-cell mutant -globin allele Large fragment 376 bp DdeI DdeI DdeI (a) DdeIrestriction sites in normal and sickle-cell alleles of -globin gene. Sickle-cellallele Normalallele Largefragment 376 bp 201 bp175 bp (b) Electrophoresis of restriction fragments from normal and sickle-cell alleles. Figure 20.9a, b Pontmutációk kimutatása RFLP-vel. Rerstrikciós fragment length polimorfizmus

More Related