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第三章 酶（ En zyme ）

第三章 酶（ En zyme ）. Introduction 酒的发酵 1( 葡萄糖 )  2( 乙醇 )+2(CO 2 ) 1913 年 Michaelis 和 Mentenj 提出 米氏学说 ( 酶促动力学原理 ) 1926 年 Sumner 第一次从刀豆中提出了 脲酶结晶 。证明了酶是蛋白质。. 第一节 Concept of Enzyme. 一．酶是生物催化剂

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第三章 酶（ En zyme ）

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  1. 第三章 酶（Enzyme） Introduction • 酒的发酵1(葡萄糖)  2(乙醇)+2(CO2) • 1913年 Michaelis和Mentenj提出米氏学说 (酶促动力学原理) • 1926年 Sumner 第一次从刀豆中提出了脲酶结晶。证明了酶是蛋白质。

  2. 第一节 Concept of Enzyme 一．酶是生物催化剂 　　酶是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。它不同于化学上的催化剂，反应条件温和、稳定：　①　很强的催化效率　②　高度的专一性　③　酶促反应没有副反应　④　酶的催化作用可以调控　⑤　酶的化学本质是蛋白质

  3. 一． 酶是生物催化剂（续） (一) 酶与一般催化剂比较有如下共性： 1．用量少而催化效率高 2．不改变化学反应的平衡点(平衡常数)　　　只改变反应速度 3．可降低反应的活化能 非催化过程及催化过程自由能的变化(见图)

  4. (二) 酶的特性 1． 催化效率高 2． 酶的作用具有高度的专一性 　一种酶只能作用某一类或一种特定的物质。　被酶作用的物质，称为该酶的底物。 3． 酶容易失活　凡使蛋白质变性的因素，如强酸、强碱、高温或高光强等条件可使酶完全失去活性。

  5. (二) 酶的特性(续) • 酶的活力是可以调节控制的　　　　抑制调节　　　　共价修饰调节　　　　反馈调节　　　　酶原调节　　　　激素调节 • 酶的催化活力与辅助因子有关 辅酶、辅基、金属离子

  6. 酶的专一性 (Specificity) Absolute ~: 只作用于一种底物。 如脲酶、H2O2酶。 Relative ~: 对(结构相似的)某一类物质起作用。 又可分为三种： 键专一性：e.g. 脂肪酶 基团(簇)专一性： e.g. 胰蛋白酶、α-D-糖苷酶 立体异构专一性： 首先看底物有无(旋光、几何)异构

  7. 二．酶的化学本质 (一) 酶的化学本质是蛋白质　“所有的酶都是蛋白质”——但也有RNA。 　　　 简单蛋白质　　　 结合蛋白质 Key Point: • 并非所有的蛋白质都是酶。只有具有催化作用的蛋白质才是酶。 • 酶的概念的发展与完善。

  8. 二．酶的化学本质 (二) 酶是细胞内产生的，可作用于胞内胞外。 胞内酶 胞外酶

  9. 第二节 酶的化学组成、结构与功能的关系 一．酶的组成、分类与辅助因子 （一）依组成可分为 单纯酶：只有蛋白质。如水解酶 结合酶：除蛋白质外，还结合非蛋白成分，称 全酶。 全酶 = 酶蛋白 + 辅因子(co-factor) 判断：活性？

  10. 一．酶的组成、分类与辅助因子(续) 辅因子(co-factor): • 按其与蛋白质结合牢固程度可分为： 辅酶：非共价的松散结合，易分离透析 辅基：结合较紧不能透析将它分开 • 按化学本质分为： 无机金属元素：Cu2+、Zn2+、Mg2+ 小分子有机物：Vt、铁卟啉

  11. 一．酶的组成、分类与辅助因子(续) 结合酶各组分的作用: • 酶蛋白： 决定酶催化反应的专一性。 • 辅助因子： 决定酶催化反应的类型。 传递氢、电子、原子或其它基团

  12. 一．酶的组成、分类与辅助因子(续) 结合酶各组分的作用: • 一种酶蛋白只有与其特定的辅助因子结合才有催化作用。 但同一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。 如：脱氢酶的NAD+ • 金属离子作为辅助因子的作用： 酶活性中心的组成成分 e.g.传递电子、“桥梁” 稳定酶催化活性中心的空间构象

  13. 一．酶的组成、分类与辅助因子(续) （一）依酶的结构可分为 单体酶：只有一条多肽链(一个亚基)，有时-S-S-连 接两条肽链。 寡聚酶：几到几十个亚基以非共价结合。 多酶体系： 完整细胞内某一代谢过程中由若干酶 形成的反应链体系。也叫“多酶复合体”。

  14. 二．酶的活性中心和必需基团 （一）活性中心：(active site) 能与底物结合，并与催化作用直接相连的部位。 结合中心：决定酶促反应的专一性 (binding site) 催化中心：决定酶促反应的性质(类型) (catalytic site) 单纯酶与结合酶有所不同。 Key Point: 能结合，但不一定发生催化反应。

  15. 二．酶的活性中心和必需基团 （二）必需基团： 指酶蛋白上与酶活性密切相关的基团。这些基团经化学修饰(如酰基化、烷化)作用，酶会失活。 • 必需基团在酶蛋白上，而辅助因子是非蛋白部分。 • 必需基团往往分布于酶的活性中心；有的不在此处，但对酶维持活性所需的空间构象起稳定作用。 • 活性中心肯定是必需基团，而必需基团除活性中心外，还有位于非活性中心的某些基团。

  16. 三．酶原的激活 酶原： 指具有催化活性的酶的前身，本身无活性。 两个问题：细胞内酶产生于何处？在哪里起作用？ 意义： • 保护形成酶原的部位不受该酶的破坏。 • 酶活可以调控的很好例子之一。 NB 并不是所有酶都以酶原形式存在。

  17. 四．同工酶 同工酶： 指在同一细胞内，可以催化相同的化学反应，但其结构不同、性质不完全相同的一类酶。 e.g. LDH（乳酸脱氢酶） 问题：酶的特异性与同工酶现象有何关系？ 说明：这几种酶的活性中心相同。即构成活性中心的基团形成相同的结构、构象或非常相似。但这又仅仅是定性的。 其物理化学性质、反应速率、催化机理可能很不一样！

  18. 第三节 酶的分类与命名 一、酶的命名 二、酶的分类 三、酶的编号

  19. 一、酶的命名 习惯命名法： （accustomed name） -酶的底物 -酶催化反应的性质 -二者结合命名 -再加上酶的来源等特点 国际系统命名法： （systematic name） 标明酶的底物和催化反应的性质

  20. 二、酶的分类 Enzyme classification: According to the international Enzyme Commission (EC), enzymes are classified into 6 major groups defined by the reaction that they catalyze.

  21. 二、酶的分类 Enzyme classification: (continued) 氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂合酶类 异构酶类 合成酶类

  22. 三、酶的编号 EC number: According to the international Enzyme Commission (EC), Each enzyme has a unique four-digit classification number. For example, LDH has the EC number EC 1.1.1.27 (Lactate DeHydrogenase)

  23. 第四节 酶的作用机制 一、酶促反应与活化能(略) 二、中间产物学说 三、诱导契合学说 四、与酶的高效催化性有关的因素

  24. 二、中间产物学说 Without Catalysis of Enzyme: SP With Catalysis of Enzyme: S+EE-SE+P • Experimental evidence: Peroxidase (POD):4 spectral bands POD+H2O2: 2 new spectral bands POD+H2O2+AH2:4 spectral bands • Electronic microscopy: E-S complex

  25. 三、诱导契合学说 Induced-fit hypothesis (model): \\ the lock-and-key model (hypothesis) Active site & substrate specificity • S对E的诱导，使E的空间构象改变 • S与E互补契合

  26. 四、与酶的高效催化性有关的因素 酶实现高效催化的因素有四： • 邻近与定向效应 \\ 酶的逼近与定位 • 底物变形 \\ 张力学说S-E complex • 共价催化 如亲核催化 • 酸碱催化 作为质子供体或受体 NB 对某些酶而言，并非每个因素都涉及。

  27. 第五节 酶促反应动力学 Kinetics of Enzyme-Catalyzed reaction: • Enzyme velocity • Factors affecting enzyme activity

  28. Enzyme velocity 指单位时间内底物的消耗量或产物的生成量。 即 v = dP / dt = -dS / dt 一般以酶促反应的初速度（initial velocity, v0）表示。

  29. Factors affecting enzyme activity Kinetics of Enzyme-Catalyzed reaction: • [S] • pH • Temp • [E] • Activators • Inhibitors

  30. Factors affecting enzyme activity • [S]-v & Michaelis-Menten equation (Figure ) To begin with Michaelis-Menten Equation, V= Vmax [S] / (Km + [S]) And Km is a constant. When Km >> [S], V= Vmax [S] / Km(?) When Km << [S], V= Vmax (?)

  31. Factors affecting enzyme activity • [S]-v & Michaelis-Menten Equation Assay of Km : When v=1/2 vmax , Km = [S] or Lineweaver-Burk plot: 1/v= (Km + [S]) / vmax [S]= (Km / vmax)1/[S]+1/ vmax i.e. X-intercept: -1/Km Y-intercept: 1/vmax

  32. Factors affecting enzyme activity • [S]-v & Michaelis-Menten Equation Km’s meaning & applications: • Km是v=1/2 vmax时的[S]。 • 与酶的催化性质有关，而与酶的浓度无关。 • 近似地表示酶与底物的亲和力 • 可依据Km选择天然底物

  33. Factors affecting enzyme activity 2. pH 3. Temp At the optimum pH and temperature, the rate of the reaction catalyzed by the enzyme is at its maximum. Application? e.g. lower or higher pH & Temp

  34. Factors affecting enzyme activity 4. [E] It is noticed that Km is a constant. Then, When [S] >> [E], v [E] (Enzyme had been over-saturated.)

  35. Factors affecting enzyme activity 5. Activators Indicating substances which can increase activity of enzyme. Inorganic ions: metal ions e.g. K2+, Zn2+, Mg+, Na+ anion e.g. Cl-, I- Small organic substance e.g. GSH, Cys Applications?

  36. Factors affecting enzyme activity 6. Inhibitors 一些物质不使酶蛋白变性，但能使其必需基团发生变化，使酶活降低甚至丧失，导致v下降。 • 酶的活性降低、丧失的三种情况 • 可逆的抑制作用 • 不可逆的抑制作用

  37. Factors affecting enzyme activity 6. Inhibitors 1). 酶的活性降低、丧失的三种情况 失活作用 酶蛋白变性，不可逆 去激活作用 可除掉激活剂 抑制作用 活性中心基团或必需基团化学性质改变 失活（未引起酶蛋白变性） 根据抑制（作用）程度分为可逆和不可逆两种抑制。

  38. Factors affecting enzyme activity 6. Inhibitors 2). 可逆的抑制作用 (reversible inhibition) (Any examples discussed before？) • Competitive ~ • Noncompetitive ~ • Uncompetitive ~

  39. Competitive ~ (竞争性抑制) • \KEY point\ • A competitive inhibitor (I) typically has close structural similarities to the normal substrate (S) for the enzyme (E). • Itcompeteswith substrate moleculesto bind to the active site. The degree of inhibition is decided by the ratio [S] / [I]. • Release from inhibition: [S] or dialysis (透析) • Kinetics: vmax remains constant, Km (figure)

  40. EXAMPLES: Vitamin B11(叶酸)，对氨基苯甲酸为其重要成分 叶酸  (合成酶、NADPH) FH2  (还原酶)  FH4 NB FH4是核酸合成所必需的。 而细菌复制只能利用自身合成的FH4。 FH2竞争性抑制剂： 氨基喋呤 应用？ 对氨基苯磺酸 如：杀菌消炎

  41. b. Noncompetitive ~ (非竞争性抑制) • \KEY point\ Inhibitor binds reversibly at a site (necessary group) other than the active site. The enzyme (E) may bind [I] or [S], or BOTH. complex with three components: ESIinactivation The degree of inhibition is decided by [I]. • Release from inhibition: removing [I] • Kinetics: Km remains constant, vmax (figure)

  42. c. Uncompetitive ~ (反竞争性抑制) • \KEY point\ Inhibitor binds reversibly at a site (necessary group) other than the active site. BUT the enzyme (E) can only bind [I] after it had bound [S]. complex with three components: ESIinactivation • Release from inhibition: remove [I] • Kinetics: Km, vmax (figure)

  43. Factors affecting enzyme activity 6. Inhibitors 3). 不可逆的抑制作用 (irreversible ~) • \KEY point\ E and I bind tightly with covalent bond. The inhibitor could not be removed by dialysis. The degree of inhibition is related to [I] and time.

  44. Factors affecting enzyme activity 6. Inhibitors 3). 不可逆的抑制作用 (irreversible ~) • EXAMPLES e.g. Pesticide (农药) DFPA (二异丙基磷酸)—Serine residue TPCK (甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲酮)—Histidine

  45. 6. Inhibitors3). 不可逆的抑制作用 (irreversible ~) • Classification of irreversible inhibitors: 有机磷杀虫剂：与E的活性中心Ser的-OH结合 有机砷、有机汞：与E活性中心含-SH部位反应 CO、氰化物类：与cyt氧化酶中Fe2+结合O2不足 重金属：使蛋白质变性。如：铜、银、汞铅等 烷化剂：卤化物与-SH结合，使之烷化，酶活降低 e.g. E-SH + CH2ICOOHE-S-CH2COOH + HI (检验酶类的活性中心是否含-SH的方法)

  46. 第六节 酶的活力测定 一、酶的活力单位 (enzyme activity unit, U) 酶活是在催化反应中体现出来的：反应速率大小、快慢。以单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的形成量来表示。 Unit =1 mol/min (IU) Kat =1 mol/s =6×107 U 二、比活力 (specific activity) 每mg蛋白质具有的活力，即U/mg.protein

  47. 三、例：酶的活力测定 已知某一酶提取物的比活力为40，每ml溶液含12mg酶蛋白。如果1ml反应液中加入了20 l酶液，该酶促反应的速度是多少？ We know U=1 mol/min, then the activity of E is 40 mol/min.mg Now, 12 mg/ml × 20 l has been added in.  24 × 10-2 mg.protein in 1 ml reaction solution 24 × 10-2 mg × 40 mol/min.mg = 9.6 mol/min

  48. 第七节 酶的活力调控 (Control of enzyme activity) 调节酶: 共价酶 (covalent enzymes) 别构酶 (allosteric enzymes)

  49. 一、共价酶--可逆的共价修饰调节 酶蛋白分子上某些氨基酸残基侧链（指酶的活性中心）在其他酶的作用下产生共价结合或脱掉一些基团，使酶的活性发生改变。 e.g. 磷酸化酶 (催化肝组织里糖元<amylum in plants>降解)，由4个亚基组成，其磷酸化后才有活性，这需要另一种酶(磷酸化酶激酶)催化。 (figure)

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