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muva kempten Dr. Monika Knödlseder

Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele. muva kempten Dr. Monika Knödlseder. Beispiele: Bifidobakterien Laktobazillen Cronobacter PCR. Bifidobakterien. Bifidobakterien. werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt

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muva kempten Dr. Monika Knödlseder

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Presentation Transcript

  1. Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele muva kempten Dr. Monika Knödlseder

  2. Beispiele: • Bifidobakterien • Laktobazillen • Cronobacter • PCR

  3. Bifidobakterien

  4. Bifidobakterien • werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt • keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien • ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

  5. Bifidobakterien • ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E) • Für Milchprodukte • IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland) • Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP) • Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen) • Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert

  6. Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur) Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren 12 - 15 ml TOS-MUP-Agar Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob • Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur Evtl. F6PPK Assay Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: • Alle Platten mit ≤ 300 Gesamt-Kolonien • Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen

  7. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.

  8. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich • Methode 1 • muva-Methode • Nachweis mit RCM-Agar • Spatelverfahren • anaerob • Methode 2 • ISO-Vorschlag • Nachweis mit TOS- MUP- Agar • Gussplattenverfahren • anaerob

  9. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

  10. Bifidobakterien Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

  11. Bifidobakterien • Nachteil: • Bezug des Nährbodens in Japan • kein europäischer Anbieter (derzeit)

  12. LAKTOBAZILLEN

  13. gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?! am Beispiel LAKTOBAZILLEN

  14. Laktobazillen Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4 Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie -> KOH: negativ -> Katalase: negativ - Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien) • Identifizierung der Spezies: • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) • oder FTIR-Spektroskopie

  15. Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – „gleiche“ Ergebnisse Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25% Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1 Lb. delbrueckii Probe 2 Lb. delbrueckii Probe 3 Lb. delbrueckii Probe 4

  16. Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

  17. Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Kultur Lb. delbrueckii Joghurtproben mit Kultur Lb. delbrueckii

  18. Laktobazillen Zusammenfassung: • Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar • bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis

  19. Laktobazillen Zusammenfassung: Aber: • in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl • bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies) • bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)

  20. Cronobacter – E.sakazakii

  21. Enterobacter sakazakiiISO/TS 22964IDF/RM 210:2006 Probe:-milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories Inkubation bei 37 ± 1 °Cfür 18 h ± 2 h gepuffertes Peptonwasser Inkubation bei 44 ± 0,5°C für 24 ± 2 h Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden Inkubation bei 44 ± 1°C für 24 ± 2 h Bestätigungstests

  22. Prüfmittel Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten Selektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiert

  23. Cronobacter • Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung • Optimierung des Verfahrens • Horizontales Verfahren • Derzeit in der Diskussion: • Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C • Austausch der Selektivmedien • Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST) • Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)

  24. PCR - Verfahren

  25. Hohe Spezifität • Hohe Sensitivität • Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie Gesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren • Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar • Vielseitige Einsatzmöglichkeiten • Mikrobiologie • GMO • Tierartendifferenzierung • Pathologie…… Potential der PCR

  26. PCR / real – time PCR Wie geht man mit positiven Befunden um? Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?

  27. PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG) (2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind…. • Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen • die Rückstellproben des Probenmaterials • die Isolate • während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren • der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.

  28. Was tun?

  29. Kompetenz des Labors • Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen • Laborkompetenz: Bsp. • Ringversuche • Interne Kontrollen • Prüfmittelüberwachung • Schulung - Laborbegehungen Qualitätssicherung im Labor • Mikrobiologisches Fachwissen

  30. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Unser Team: Dr. Christine Bürk Dr. Ursula Hartmann Marion Seidl Isolde Degle Dr. Karlheinz Friedrich Dr. Monika Knödlseder

  31. 5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar • 5.3.1 Composition • Tryptic digest of casein • Yeast extract • Sodium chloride (NaCl) • 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside • Sodium desoxycholate (C24H39NaO4) • Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3) • Sodium thiosulfate (Na2S2O3) • Agar • Water • Kein Crystal violet

  32. 5.2. Cronobacter screening broth (CSB) • 5.2.1 Base medium • Enzymatic digest of animal tissues • Meat extract • Sodium chloride (NaCl) (weniger) • Bromocresol purple • Sucrose (C12H22O11) • Water • 5.2.2. Vancomycin solution

  33. Bifidobakterien –Nährmedien Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung

  34. Laktobazillen - Nährmedien Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller

  35. Übersichtsschema

  36. Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses: • Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien • Alle Kolonien werden gezählt • Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g • Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet

  37. Kompetenz des Labors • Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden? • Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil? • Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)

  38. Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I • In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft → Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs: 2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g → Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g

  39. Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse • In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich: es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren: • Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung • Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind) • Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil) (aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)

  40. Eingesetzte Volumen für die PCR • Von 5 μl bis 1 ml • BAX 5 μl • Roche 1 ml • EHEC 1 ml

  41. Verordnung zur Durchführung von Vorschriftendes gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern • § 3: Betriebseigene Kontrollen • (1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen • Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.

  42. Bifidobakterien – Methoden-vergleich Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert Bifidobakterien Laktob.

  43. Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%

  44. Laktobazillen - Nachweis Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob • Bestätigung und Zählen der Kolonien: • - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen • -> KOH: negativ • -> Katalase: negativ • - Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und • Angabe als KbE /ml oder KbE/g • Identifizierung der Spezies: • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) • oder FTIR-Spektroskopie

  45. Grenzen der Mikrobiologie: • fehlende Nachweismethode • trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden • unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen • unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)

  46. Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob (bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C) • Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm Bestätigungstests: • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv) • Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g Bifidobakterien- Nachweis Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar:

  47. Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen Inkubation: 72 ± 4 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob • Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie) • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv) • Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g Bifidobakterien- Nachweis Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

  48. Leistungs-potentiale Moderne Methoden : • PCR: • Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage • Listerienanalyse ca. 2 Tage • STEC ca. 2 Tage • Cronobacter ca. 2 Tage • FTIR Analyse: Absorption aller Zellbestandteile → Chemische Zusammensetzung des Keimes wird „dargestellt“ → definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet

  49. Bifidobakterien – Zusammen-fassung Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

  50. Laktobazillen

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