EFFETTI BIOLOGICI DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI

1. Incontri di Fisica 2009 EFFETTI BIOLOGICI DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI Ubaldo Bottigli Università di Siena & Sezione INFN di Pisa bottigli@unisi.it LNF 7-9 Ottobre 2009

2. CSN5 – Fisica ApplicataRicerche Tecnologiche di avanguardiamirate ai temi scientifici ed agli esperimenti dell’INFN • I progetti finanziati dalla CNS5 si collocano nel campo della strumentazione dedicata agli esperimenti di fisica nucleare, sub-nucleare ed astro-particellare: • Rivelatori di particelle, sviluppi di elettronicae software • Acceleratori di particelle, sviluppi di elettronicae software • Applicazioni di tecniche d’avanguardia neisettori inter-disciplinari e delle scienze della vita

3. Ottima Buona Sufficiente Pessima Ricerca Fondamentale Ottima Buona Sufficiente Pessima Ricerca Applicata CSN5 – Fisica Applicata La CSN5 esiste fin dalla nascita dell’INFN e quindi ben prima della “attuale presunta richiesta governativa di applicazione”. I padri fondatori hanno pensato che una

4. Effetti biologici delle radiazioni e dosimetria

5. Dose La dose è l’energia assorbita per unità di massa: Gy = J/Kg = m2/s2 1 Gy = 100 rad

6. Equivalente di dose From ICRP n. 60 (1991) Radiation Radiation Weighting Factor (wR) X and g rays, electrons(*) 1 Protons (E>2MeV) 5 Neutrons (energy dependent) 5÷20 a particles and other multi-caharged 20 (*)wR=1 for electrons of all energies except for Auger electrons emitted by nuclei bound to DNA L’equivalente di dose è un fattore (wR) moltiplicativo che indica il danno biologico relativo a parità di dose fisica: Unità: Sievert, (Sv). Se wR = 1, allora 1 Gy = 1 Sv Vecchie unità = 100 rem = 1 Sv

7. Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione Le radiazioni ionizzanti possono danneggiare direttamente il bersaglio molecolare, oppure ionizzare l’acqua e quindi produrre radicali liberi che aggrediscono a loro volta le molecole. Le radiazioni ionizzanti producono i danni sia direttamente, colpendo la cellula, sia indirettamente, ionizzando l’acqua, la quale a sua volta, genera dei radicali liberi che attaccano il bersaglio cellulare.

8. Modelli di sopravvivenza cellulare Un grafico della frazione di sopravvivenza vs la dose, mostra due tipi di meccanismo di danneggiamento: il tipo-A (curva tratteggiata) ed il tipo-B (curva intera). Linear-Quadratic Model

9. Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione Le radiazioni ionizzanti possono danneggiare direttamente il bersaglio molecolare, oppure ionizzare l’acqua e quindi produrre radicali liberi che aggrediscono a loro volta le molecole.

10. Effetti sulla molecola del DNA • La irradiazione può produrre vari tipi di alterazioni nella struttura della molecola del DNA per effetto diretto o indiretto • alterazioni delle basi pirimidiniche (T , C ) o puriniche (A , G ) • alterazioni del desossiribosio • rottura di legami con distacco di frammenti e formazione di nuovi legami nello stesso filamento o crociati • rottura di un singolo filamento dell’elica (Single Strand Break) • rottura di entrambi i filamenti (Double Strand Break) per effetto di una singola traccia o di due tracce contemporanee (hot spots)

11. Effetti del danno del DNA (End-point biologici) • Riparazione completa con restitutio • avviene per la grande maggioranza delle alterazioni minori • la cellula riprende la sua normale attività • Riparazione erronea (misrepair) • la cellula muore dopo alcune divisioni(morte mitotica ritardata) • la cellula muore senza dividersi per accelerazione della morte programmata(apoptosi) • la cellula non muore ma presenta mutazioni che possono modificare alcune funzioni • Fissazione non riparabile del danno • la cellula muore subito nel giro di ore per liberazione di enzimi litici indipendentemente dalla mitosi (morteinterfasica); riguarda alcune specie cellulari specifiche (linfociti, ovociti, cell. salivari sierose) • la cellula muore in occasione del primo evento mitotico (mortemitotica) o dopo alcune mitosi (mortemitoticaritardata) Il danno non riparabile è sostanzialmente rappresentato dalle doppie rotture (DSB)

12. La risposta delle cellule dipende… • dal rate di dose • dal tipo di cellula • dalla fase del ciclo cellulare • dalla presenza dell’ossigeno

13. Come se non bastasse…….la Dosimetria Gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti dipendono, come abbiamo visto, da molteplici fattori fisici e biologici e riguardo a quest’ultimi possiamo individuare tre bersagli interessanti: la cellula l’organo l’organismo Non è immediata la generalizzazione dei risultati ottenuti su di un bersaglio rispetto agli altri.

14. Il problema delle basse dosi Dosi non letali dal cGy al Gy in funzione del bersaglio

15. Il problema delle basse dosi Negli Stati Uniti sono state eseguite 62 milioni di Tac nel 2006, contro i tre milioni del 1980 [the New England Journal of Medicine (NEJM) Nov. 2007]

16. Il problema delle basse dosi

17. Il problema delle basse dosi Forum europeo (2010-2025) sul problema degli effetti sulla popolazione delle dosi dovute ad esami di imaging biomedico. Presidenza italiana del forum ISS Forum

18. Un Programma di lavoro Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Comprensione degli effetti non-lineari Contributo alla valutazione del rischio

19. EXCALIBUR (EXposure effeCts At Low-doses of Ionizing-radiation in Biological cultURes) BO CA/SS LNF LNGS LNL PV PI/SI Roma3 APPROVATO

20. Dose dall’ambiente Equivalente di dose annuale media è ~3 mSv

21. Dose media per irraggiamento esterno (mSv/y) da fondo naturale G. Moschini, G. Pavarin, M. Pelliccioni, E. Righi

22. Esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Contributo delle varie sorgenti naturali di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all’uomo negli U.S.A. Contributo relativo delle varie sorgenti di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all’uomo nel mondo. Principali sorgenti naturali “Terrestri” e loro vite medie Contributo alla dose media annuale delle principali sorgenti di irraggiamento interno 22 S.C. Bushong, 1998 F.A. Mettler et al, 1995

23. Valutazione di rischio alle basse dosi (E.J. Hall, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 65, No. 1, pp. 1–7, 2006) • Studi a dosi medio-alte: • - studi in vitro: irraggiamenti a “fascio largo” • - studi epidemiologici: sopravvissuti di Hiroshima e Nagasaki, minatori di uranio, Chernobyl, popolazione medicalmente esposta • + Estrapolazione alle basse dosi •  assunzione cautelativa in radioprotezione: andamento lineare alle basse dosi ? • Studi epidemiologici diretti a basse dosi • - misura dell’esposizione indoor di radon e correlazione con l’incidenza di cancro ai polmoni •  problemi metodologici nella determinazione dell’esposizione dell’individuo

24. Obiettivi Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti, con particolare riguardo agli effetti “non-lineari” (ipersensibilità, radioresistenza indotta, risposta adattativa, effetti di bystander..) 1. Studio dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in colture cellulari, in funzione della qualità della radiazione (raggi γ/X; protoni, alfa e ioni pesanti di varie energie) 2. Studio dell’influenza dello stato di crioconservazione sulla risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e in-vivo, esposti al fondo naturale di radiazioni. 3. Contributo alla valutazione di rischio per esposizioni alle basse dosi di R.I. 4. Sistematica di effetti biologici indotti in diversi sistemi cellulari di mammifero, in coltura o crio-conservati, in funzione della qualità della radiazione e della dose(nel regime delle basse dosi), inclusi sistemi “in-vivo” (embrioni di pecora)

25. Stato dell’arte (1) • Per esposizioni alle basse dosi di R.I. (<0.5 Gy) in radioprotezione, in via cautelativa, la valutazione di rischio è effettuata estrapolando i dati delle alte dosi, mediante una relazione “lineare senza soglia” (LNT, Linear No-Threshold cancer risk model), con l’assunzione “a prioristica” che gli organismi viventi rispondano allo stesso modo alle basse come alle alte dosi. • In effetti, evidenze sperimentali accumulate negli ultimi 15 anni hanno mostrato la presenza di effetti “non-lineari” specifici alle basse dosi, non riscontrati alle alte dosi, quali: • l’ipersensibilità e la radioresistenza indotta (HRS/IRR); • l’effetto bystander (BE); • l’instabilità genomica.

26. Stato dell’arte (2) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Fenomeni di ipersensibilità e radioresistenza indotta sono stati riscontrati in più di 40 linee cellulari in vitro (umane, normali e tumorali, e di roditore), in seguito a irraggiamenti con basse dosi di radiazioni di raggi X/. In esperimenti di sopravvivenza cellulare, tali effetti si traducono in una deviazione per dosi < 1 Gy dal convenzionale andamento lineare o lineare-quadratico delle curve dose-risposta, con una mortalità maggiore (HRS) alle dosi più basse e radioresistenza (IRR) successiva al crescere delle dosi.

27. Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità (HRS) e Radioresistenza indotta (IRR)(Marples and Joiner,Int. J. Radiat. Biol. 2001, vol. 77, 1133-1139) • Irraggiamenti cellulari con RX: • Cellule normali e tumorali di ≠ radiosensibilità • Iper-sensibilità alle basse dosi • Radioresistenza indotta Meccanismo protettivo indotto da basse dosi di radiazioni Con neutroni e pioni di alto LET: Andamento lineare (no HRS/IRR)

28. Stato dell’arte (3) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Più recentemente HRS/IRR sono stati osservati anche con radiazioni densamente ionizzanti (ioni pesanti) in cellule di roditore,in contrasto però con quanto osservato con neutroni, pioni nel picco di Bragg e protoni di alta e bassa energia.

29. … Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (E.Tsoulou et al., Int. J. Rad. Biol. (2001),vol. 77, 1133-1139) • at LNL: broad ion beam cell irradiations: • 60Co g-rays and 4He2+ ions • of different energies • (59, 79 and 102 keV/mm LET) • Chinese hamster V79 cells • Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS) • Radioresistenza indotta (IRR)

30. Effetto “Lazzaro” …Effetti delle basse dosi (studi in vitro)G. Borhnsen et al., Radiat. Prot. Dos.(2001),vol. 99, 255-256Tsoulou,..,Cherubini et al., Radiat. Prot. Dosim. 99(2002) 237-240 GSI SIS facilty scanned pencil beam and LNL broad ion beam cell irradiations: • 6MV photons and 12C6+ ions of 92.5 MeV/amu on target (27.5 keV/mm LET) • 60Co g-rays and 4He2+ ions of different energies (59, 79 and 102 keV/mm LET) • Chinese hamster V79 cells • Low dose hyper-radiosensitivity • Induced radioresistance

31. Stato dell’arte (4) Effetto bystander (BE) In esperimenti in vitro è stato osservato che il danno da radiazione è espresso anche in cellule non direttamente interessate dal deposito energetico, ma vicine (a contatto o non) a cellule irradiate. Tale effetto è stato riscontrato, in molte linee cellulari (di roditore, umane normali e tumorali), per diversi end-point biologici (scambi di cromatidi fratelli, aberrazioni cromosomiche, micronuclei, apoptosi, morte clonogenica, trasformazioni oncogeniche, mutazioni) e con diversi approcci sperimentali (irraggiamenti con “micro fasci” di RX o ioni; irraggiamenti con fasci “larghi” di ioni o con sorgenti con mascheramento di parte della popolazione cellulare esposta; esperimenti di trasferimento del terreno di coltura da una popolazione irraggiata a una non irraggiata; esperimenti di co-cultura tra popolazione irraggiata e non).

32. 1 cellula colpita all’interno di una popolazione Danno (morte cellulare, apoptosi, induzione di micronuclei, trasformazioni oncogeniche) espresso in più di 1 cellula(..evidenze sperimentali..) Quali meccanismi di induzione e trasmissione del danno?...  secrezione di fattori citotossici nel mezzo di coltura da parte delle cellule irraggiate  comunicazione diretta tra cellule attraverso “gap-junction” ….  ROS/RNS (NO); …. By soluble molecules? By gap-junction? Effetti delle basse dosi: Bystander effect

33. Mitocondrio produce energia (possiede il suo DNA - mtDNA) Citoplasma Nucleo = sede del materiale Genetico (DNA) Citoplasma Radiazione Interazione diretta (e-) e indiretta (ROS) N = Nucleo (  8 μm ) Modificato da L.E. Feinendegen,2005 ©SG2008

34. =Bystander Effects Signaling between Tissue Cells and Matrix Hit Cell Gap Junction Tissue L.E. Feinendegen, 2005 Cells Matrix Ulteriore “Open problem”: Qual è il “target” della radiazione?

35. Riassunto effetti delle basse dosi • Priming dose: 5-40 cGy RX • qualche h prima dell’irraggiamento 2) Irraggiamento (Challenging dose) Osservato: • in vivo e in vitro (protozoi, alghe, cell vegetali e di mammifero) • per diverse linee cellulari • per diversi end-point biologici (mutazioni, trasformazioni oncog., micronuclei, danno cromosomico e sopravvivenza cellulare)

36. Stato dell’arte (5) Instabilità genomica L’esposizione a radiazioni può dareinizio ad una cascata di eventi che produce un aumento del rateo di alterazioni nel genoma delle progenie di cellule irraggiate che non hanno manifestato un danno immediatamente dopo l’irraggiamento (effetti tardivi). L’instabilità è stata misurata in termini di una molteplicità di end-point biologici, ma con particolare attenzione al danno cromosomico. Anche tale effetto è stato evidenziato per diverse linee cellulari (cellule umane normali, linfociti umani, etc..) nonché per radiazioni sia a basso che ad alto LET. L’instabilità genomica è stata anche riscontrata nella progenie di cellule non direttamente irraggiate, ma in comunicazione, attraverso gap-junction o terreno di coltura, con cellule irraggiate, evidenziando una possibile relazione di tale effetto col BE.

37. Effetti delle basse dosi: Instabilità Genomica L’esposizione a radiazioni produce un aumento del ritmo di mutazioni con danno cromosomico nella progenie di cellule irraggiate • Alterazioni nel cariotipo (numero e morfologia cromosomica) di cell esposte a dosi di particelle α corrispondenti (in media) a 1 ione/cell • Instabilità cromosomica nel: • 3% di cloni di cell ibride umane/criceto per 1 Gy di RX; • 4% di cloni per 1 Gy di ioni ferro.

38. Stato dell’arte (6) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Il metodo di conservazione per lunghi periodi di tempo di sistemi biologici è la cosiddetta “crio-conservazione”, ovvero il loro mantenimento, con opportuni trattamenti preparatori, mediante congelamento, vitrificazione o ibernazione in opportune installazioni di laboratorio (dewar per azoto liquido, -196°C, 77 K). Alle temperature criogeniche i processi biochimici cellulari sono inibiti e quindi si impedisce la senescenza cellulare e la degradazione del materiale biologico. La tecnica è ben conosciuta e praticata (30÷40 anni) ed è ben misurato il danno prodotto nelle cellule da la procedura congelamento-scongelamento.

39. Stato dell’arte (7) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dall’ambiente in cui i sistemi biologici crio-conservati vengono depositati, essi subiranno un irraggiamento protratto per anni e spesso per decine di anni, come nel caso delle “banche” di colture cellulari o delle “banche” di cellule staminali e/o germinali, a causa del fondo naturale di radiazioni.

40. Stato dell’arte (8) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dal tempo di conservazione e mancando l’azione antagonista continua dei meccanismi di riparazione, i “danni” prodotti dall’esposizione delle cellule crio-conservate al fondo di radiazioni, in principio andranno accumulandosi, trasformando l’esposizione a “dose protratta” (bassissimo rateo di dose del fondo ambientale) in esposizione a “dose acuta”, al momento dello scongelamento e rivitalizzazione delle cellule. (CRIORAD EXP.)

41. Stato dell’arte (9) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Recenti risultati sperimentali ottenuti confrontando la risposta a raggi-g di diversi sistemi biologici in condizioni criogeniche e a temperature ambiente, in termini di vari end-point biologici, hanno mostrato un “effetto protettivo” della crio-conservazione rispetto all’azione delle R.I (raggi-g)

43. Attività sperimentale di EXCALIBUR a Settembre 2009 • Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) • Irraggiamenti raggi-X, g e particelle cariche su cromosomi ed analisi genomica • Irraggiamenti raggi-X, g e particelle cariche su cellule ed analisi membranica

44. Attività EPR (1) • Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) per misurare la concentrazione di radicali liberi prodotti da irraggiamento, allo scopo di: • determinare gli effetti dello stato di crioconservazione sulla natura e distribuzione dei prodotti radicalici; • confronto con la radiolisi in fase liquida; • effetti della dose, del rateo di dose e della natura delle radiazioni.

45. Attività EPR (2) • Metodologia: • preparazione dei campioni di cellule V79, dei terreni di coltura e di irraggiamento e dei loro componenti; • irraggiamenti a 77 oK con radiazioni  da 60Co, raggi X, H+, D+ ed ; • spettroscopia EPR in matrice e in fase liquida con agenti di spin trapping

46. Attività EPR (3) Campioni A1-A9: A1 : H2O Pura A2: H2O + DMSO* ( 10%) A3 : terreno di coltura DMEM completo A4 : Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A5 : Terreno di coltura DMEM completo + FBS A6 : Terreno di coltura completo + FBS** + DMSO = terreno di congelamento A7 : Cellule in terreno di coltura completo + FBS (1.5x107 cellule totali) A8 : Cellule in terreno di congelamento(1.5x107 cellule totali) A9: H2O + FBS *Dimetilsolfossido (DMSO) per crioprotezione cellulare **Fetal bovine serum (FBS) da aggiungere al medium di coltura per far crescere le cellule

47. Attività EPR (4) A4 Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A8 cellule in terreno di congelamento Area Totale (U.A.) Tempo di irraggiamento ( h, 0.35 kGy/h) A5 Terreno di coltura DMEM completo + FBS A1 acqua pura A9 acqua + FBS A3 terreno di coltura DMEM completo

48. Attività EPR (5) • ANALISI PARZIALE EFFETTUATA: • la presenza di DMSO aumenta la produzione di radicali liberi (metilici), la cui dinamica deve essere studiata; • i radicali OH (in misura minore anche i radicali HO2 ) sono dominanti in H2O pura e sono presenti in tutti i sistemi irraggiati. I radicali OH decadono a 140 oK senza generare nuove specie per reazione con gli altri componenti presenti; • il fenomeno descritto riduce drasticamente il danno mediato dalla radiolisi dell’acqua sulle cellule e costituisce una differenza sostanziale rispetto alla radiolisi in fase liquida; • non c’è, per ora, evidenza chiara del danno radicalico diretto o indiretto sulle cellule. Gli spettri EPR sono sostanzialmente gli stessi ottenuti dai sistemi senza cellule; • dobbiamo aumentare la popolazione di cellule nei campioni e si devono eseguire misure preliminari con sospensioni delle cellule in acqua pura.

49. Attività genomica (1) Il telomero è la regione terminale del cromosoma, da cui deriva il nome stesso, composta di DNA altamente ripetuto, che non codifica per alcun prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. La DNA polimerasi, infatti, non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione; se non ci fossero i telomeri, che quindi vengono accorciati ad ogni replicazione, la replicazione del DNA comporterebbe in ogni occasione una significativa perdita di informazione genetica. Vi sono prove che questo progressivo accorciamento dei telomeri sia associato all'invecchiamento della cellula e dell'intero organismo. Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak, Nobel per la Medicina 2009, per aver individuato l'esistenza dei telomeri e delle telomerasi, correlandone l’accorciamento con l’invecchiamento cellulare. I telomeri (in giallo) sono evidenziati sui cromosomi attraverso una Fluorescent in situ hybridization (FISH)

50. Attività genomica (2) Il telomero è composto da sequenze ripetute di DNA e da alcune proteine ed ha la funzione di proteggere le terminazioni dei cromosomi. Ciò impedisce da una parte la degradazione progressiva con rischio di perdita di informazione, dall'altra che tale regione, non presentando una corretta struttura a doppia elica, sia processata come estremità di filamento spezzato, con il rischio di fusione tra due regioni telomeriche di cromosomi diversi. I telomeri sono estesi dall'enzima telomerasi, che rappresenta una classe di retrotrascrittasi specializzate, presenti in numerosi organismi (tra cui l'uomo), ma non in tutti (e soprattutto non in tutte le fasi dello sviluppo). In particolare, nell'uomo le telomerasi (così come nella maggior parte degli eucarioti multicellulari) sono attive solo nelle cellule della linea germinale: ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri umani si accorciano di un certo numero di paia di basi.