PROTEOLIZA

1. PROTEOLIZA

2. Zorenje mesa • kompleksni biokemični procesi s pomembnimi posledicami za mikrostrukturo in funkcionalne lastnosti • vpliva na senzorične lastnosti mesa(aromo in teksturo) • začne po končani posmrtni glikolizi • od biokemičnih procesov je najpomembnejša encimska proteoliza mišičnih beljakovin • encimski proteolitični procesi so svojevrstno nadaljevanje aktivnosti mišičnih proteolitičnih encimov za življenja živali, le da so njihove aktivnosti in substrat drugačni zaradi spremenjenih razmer v mišici po končani glikolizi(drugačna vrednost pH in temperatura, izliv encimov iz poškodovanih organel idr.) • proteolitični procesi so encimska razgradnja (hidroliza) beljakovin mesa na manjše molekule, ki ohranijo strukturo, nadalje razgradnja na polipeptide in peptide, v manjši meri razcepljanje do prostih aminokislin.

3. Encimi zorenja • Proteaze: • Nevtralne proteaze ali kalpaini ali CAF • aktivator: kalcij • kje: v citoplazmi • razgrajujejo: • beljakovinev črti Z in tiste, ki jo povezujejo s tankimi filamenti (dezmin) • troponin, tropomiozin (tanki filamenti) • črto M v debelih filamentih • GAP-filamete (izhajajo iz enega konca A-filamenta in potekajo med I-filamenti skozi Z-linijo in med I-filamenti naslednje sarkomere, ter se zaključijo v A-filamentu): konektin (titin), nebulin • ne vplivajo na:miozin, aktin, a-aktinin(v črti Z)in troponin C • njihova aktivnost pada s časom zorenja mesa

4. sarkomera linija M M-linija razpolavlja H-zono debeli filament (A-segment) Z-linija troponin tropomiozin Z-linija tanki filament (I-segment) dezmin dezmin konektin miozin nebulin aktin a-aktinin Longitudinalni filamenti: titin (konektin) Transverzalni filamenti: dezmin Tanki filamenti: aktin, tropomiozin, troponin, aktinin Debeli filamenti: miozin, protein C, H in X

5. Encimi zorenja • Proteaze: • Nevtralne proteaze ali kalpaini ali CAF • molekularne lastnosti glavnih mišičnih proteinaz (Toldra, 1992) • aktivnost kalpainov pri pH 6,0 majhna (pri pH 5,6-5,9obdržijo 15–25 % aktivnosti) • razgradijo proteine do večjih peptidov in ne na manjše peptide oz. aminokisline

6. Encimi zorenja • Proteaze: • Nevtralne proteaze ali kalpaini ali CAF - ločimo: • m-kalpain:Ca2+ 50-70 mM: • razgradi se v 24 urah • odgovoren za miofibrilarno fragmentacijo in mehčanje • m-kalpain:Ca2+ 1 - 5 mM: • večja stabilnost kot zgornji • aktivnost kalpainov omejujejo: • vrednost pH in temperatura mišice po zakolu • endogeni inhibitor kalpastatin: • razgradi se v 24 urah • vežejo se na mesto vezave Ca2+ in/ali na aktivno mesto kalpainov • 1 molekula kalpastatina inhibira 4 molekule kalpainov • v mišicah jih ni dovolj, da bi zavrli delovanje vseh kalpainov

7. Encimi zorenja • Proteaze: • Lizosomske proteinaze ali katepsini: • podobni v različnih vrstah in celičnih tipih • majhne molekule (20 – 40 kDa) • optimalno aktivne v kislem in v nevtralnem pH območju • glikoproteini • katepsini B, D, H in L; delujejo na majhne peptide in velike proteinske molekule Katepsin Drazgrajuje težki meromiozin in konektin, proteina M in C, tropomiozin, troponin T in I, aktin le malo Katepsin Brazgrajuje miozin in aktin (ne lahki meromiozin in troponin C) Katepsin Lrazgrajuje težke miozinske verige, aktina, tropomiozina, a-aktinina in troponina T ter I (ne troponin C), konektin in nebulin Katepsin Hdeluje kot endopeptidaza in aminopeptidaza; razgrajuje miozin.

9. sarkomera M-linija razpolavlja H-zono debeli filament (A-segment) Z-linija troponin, tropomiozin Z-linija tanki filament (I-segment) troponin, tropomiozin meromiozin M in C protein konektin konektin miozin aktin dezmin miozin miozin nebulin aktin aktin konektin a-aktinin miozin Katepsin D Katepsin B Katepsin L Katepsin H

10. Encimi zorenja • Kolagenaza • aktivnost pri nizki temperaturi zanemarljiva • ATP-aza • majhna aktivnost • vzdržuje aktin in miozin v disociiranem stanju

11. Biokemijski procesi med zorenjem • ekstraktibilnost proteinov (1 teden p.m. - povečanje 50 do 60%) • ATP-azna aktivnost in • hidroliza proteinov • v povezavi z mehčanjem mesa: • m-kalpainska teorija • kalcijeva teorija

12. Biokemijski procesi med zorenjem • m-kalpainska teorija • temelji na proteolitski razgradnji beljakovin z μ-kalpainom • razlike v trdoti so posledica različne aktivnosti μ-kalpainov • proces proteolizezajema: • povečanje koncentracije prostih Ca2+ • aktivacijo kalpainov z Ca2+ • proteolizo mišičnih struktur s kalpaini

13. Biokemijski procesi med zorenjem • razpoložljiv prost kalcij • skupna količina Ca2+ v mišičnih vlaknih govedi je okrog 1,5 mmol/kg mišičnine (med 0,6 in 8 mmol/kg) • vživi mišici je [prostega Ca2+] 0,2 μM -prenizkaza aktivacijo • večina Ca2+ je v sarkoplazemskem retikulumu • [Ca2+] v citosolu uravnava kalcijeva črpalka - odvisna od ATP • ko nastopi celična smrt, se zaloge energijsko bogatih snovi začno zmanjševati, kar povzroči odpoved kalcijeve črpalke in povečanje [prostega Ca2+] v citosolu mišičnih vlaken • ob koncu rigorja se [prostega Ca2+] poveča na 100 μM • ta je zadostna le za aktivacijo μ-kalpaina ne pa za m-kalpain • [prostega Ca2+]je odvisna od anatomskega predela, vrste mesa, vrste mišičnih vlaken in pogojev ravnanja z mesom po zakolu –temperature skladiščenja, hitrosti zniževanja vrednosti pH…

14. Biokemijski procesi med zorenjem • aktivacija kalpaina s kalcijem • še ni neposrednih dokazov, da se po celični smrti kalpaini aktivirajo s Ca2+ in s tem pomembno prispevajo k spreminjanju teksturnih lastnosti mesa • koncentracija kalpainov sezmanjšuje in doseže minimalno vrednost po 15 dneh • podobno se dogaja s koncentracijo kalpastatinov • hkrati se izboljšujejo teksturne lastnosti mišičnine • sklepamo na aktivacijo kalpainov in porabo kalpastatina ter proteolitične procese, ki potekajo s proteinazami

15. Biokemijski procesi med zorenjem • kalcijeva teorija • meso je med zorenjem podvrženo nefiziološkim pogojem: • vrednost pH pade na okrog 5,5 • ATP popolnoma izgine in • temperatura se močno zniža na 1 do 5 °C • se zelo poveča [sarkoplazemskih Ca2+] na 0,2 mM(2000xveč) • koncentracija postopoma narašča • pri govedini pri 4 °C v 4 dneh, • pri svinjini v 3 dneh in • pri perutnini po 20 urah • kalcijevi ioni povzročajo: • slabljenje črte Z in • med rigorjem nastalih povezav miofibril • v [0,1mM Ca2+]razgradnjo konektina (titina), nebulina in dezmina

16. Biokemijski procesi med zorenjem • strukturno popuščanje miofibril • slabljenje črt Z • povezujejo sosednje sarkomere in omogočajopremikanje tankih in debelih filamentov znotraj sarkomere • slabljenje črt Z povzroča fragmentacijo sarkomer • črte Z so iz filamentov Z (iz α-aktinina in amorfnega matriksa) • amorfnimatriks je povezovalni cement med črtami Z • po zakolu - [Ca2+] 0,1mM - matriks razpade- oslabi črte Z • ta proces se dogaja tudi brez prisotnosti proteinaz • glavna sestavina matriksa so lipidi:fosfolipidi,triacilgliceroli, holesterol in proste maščobne kisline • fosfolipidiv fizioloških pogojih sovezani na α-aktinin • pri povečani konc. se Ca2+ vežejo na fosfolipide- sprememba elektrostatičnega naboja • fosfolipidi se sprostijo z α-aktinina in iz črt Z - slabitev črt Z

17. Biokemijski procesi med zorenjem • strukturno popuščanje miofibril • slabljenje povezav filamentov, nastalih med rigorjem • med rigorjem se vzpostavi močnapovezava med aktinom in miozinom • sledi oslabitev povezave in sarkomere se ponovno relaksirajo • v segmentih A in I je tudi miofibrilarni protein paratropomiozin, ki se med zorenjem mesa, pri povečani koncentraciji Ca2+ v sarkomerah, veže na aktin v tankih filamentih in tako prispeva k sprostitvi vezi med aktinom in miozinom • delež paratropomiozina (vezanega na aktin) je v povezavi s povečanjem dolžine sarkomer med zorenjem • sarkomere pri govedini dosežejo maksimalno dolžino v10 dneh • vezava paratropomiozina oslabi vezavo med aktinom in miozinom - prispeva k mehčanju mesa med zorenjem

18. Biokemijskiprocesi med zorenjem • strukturno popuščanje miofibril • razgradnja konektina (titina) • konektin je elastični protein (povezuje miozin s črto Z) • pripenja/drži miozin med kontrakcijo v določenem položaju • mišici daje elastičnost • z zorenjem mišica zgublja elastičnost in postaja bolj plastična • zgubljanje elastičnosti - povečanje mehkobe mesa • med zorenjem mesaα-konektin razpade na β-konektin in na fragment, ki ima 1200 kDa • v govedini pride do popolne razgradnje α-konektina po 10 dneh

19. Shematski prikaz razpada α-konektina na β-konektin in na fragment, ki ima 1200 kDa

20. Biokemijski procesi med zorenjem • strukturno popuščanje miofibril • razgradnja nebulina • nebulin jefilamentozni protein (800 kDa) • povezuje črte Z z aktinom • zelo tanki filamenti, stabilizacijaaktinskih filamentov v mreži z miozinom • med zorenjem se količina nebulina zmanjšuje - razgradnja na pet podenot (200, 180, 40, 33 in 23 kDa) • Ca2+se vežejo na podenote (200, 40 in 23 kDa): • razgradnja nebulina • destabilizacija organizacije tankih filamentov • mehčanje mesa med zorenjem

22. Elektroforezni SDS-PAGE gel ovčje najdaljše hrbtne mišice (z različnimi končnimi vrednostmi pH) po hranjenju pri 10 oC (a - 12 h, b - 24 h, c - 48 h po zakolu) konektin (T), nebulin (N), miozin (M)

23. Biokemijskiprocesi med zorenjem • strukturno popuščanje miofibril • razgradnja dezmina • molekule dezmina se razgradijo na manjše enote • vsebnost se pri govedini v 14 dneh zmanjša za 70 – 80 % • razpade na enote, velike 43 ~ 46, 40, 34 ~ 36 kDa • razgradnja se začne pri koncentraciji 0,01 mM Ca2+ in doseže maksimalno vrednost pri koncentraciji 0,1 mM Ca2+ • temperatura med 5 in 40 °Cne vpliva na razgradnjo dezmina

25. Biokemijski procesi med zorenjem • sproščanje aminokislin med zorenjem • posledica delovanja proteolitičnih encimov! • [prostih aminokislin=FAA]se povečuje v odvisnosti od: • časa zorenja • posameznih mišic (večja v LD) • posledica so razlike v količini in hitrosti sproščanja FAA v posameznih mišicah • poglavitno vlogo imajo katepsini (lizosomi), ki delujejo pri znižani vrednosti pH • lizosomi se navadno razgradijo 5 dnipost mortem • vsebnost FAA se poveča predvsem po 10-tem dnevu pri 4 °C • razgradnja kolagena po 10-tem dnevu - povečanje Hypro • vsebnost krajših peptidov se povečuje -endopeptidaze

26. Vsebnost posameznih prostih aminokislin (mg/g) v govejih mišicah longissimus dorsi (LD), triceps brahii (TB) in rectus femoris (RF) 3 dni (D3), 5 dni (D5), 10 dni (D10) in 14 dni (D14) post mortem(Fieldt in sod., 1996)

27. Spremembe mikroskopske zgradbe mesa • med zorenjem se spremeni zgradba mišičnih vlaken oz. miofibril: • parcialna destrukcija črte Z

28. Spremembe mikrostrukture črte Z v mišici semitendineus goved med zorenjem(Gann in Merkel, 1978) a) eno uro po smrti • delna destrukcija črte Z • 3 dni po smrti

29. Spremembe mikroskopske zgradbe mesa • med zorenjem se spremeni zgradba mišičnih vlaken oz. miofibril: • parcialna destrukcija črte Z • pojav razpok na meji med črto I in Z v sarkomerah

30. Fragmentacija miofibril na zvezi med črto Z in I v mišici semitendineus goveda 9 dni po smrti

31. Spremembe mikroskopske zgradbe mesa • med zorenjem se spremeni zgradba mišičnih vlaken oz. miofibril: • parcialna destrukcija črte Z • pojav razpok na meji med črto I in Z v sarkomerah • razpoke se poglabljajo in njihovo število povečuje, končno pa pride do fragmentacije miofibril • hitreje razpada zveza I - Z v belih kakor rdečih mišičnih vlaknih

32. Mikroskopska zgradba mišice semitendineus goveda med zorenjem a) 3 dni po smrti (x3150) d) 14 po smrti (x20) b) 7 dni po smrti (x2100) c) 9 dni po smrti (x2100) e) 28 po smrti (x20)

33. Spremembe mikroskopske zgradbe mesa • o vplivu zorenja na mikroskopsko zgradbo vezivnega tkiva je opravljenih malo raziskav • vezivno tkivo se med zorenjem mikroskopsko opazno ne spremeni

34. Spremembe na endomiziju (puščica) post mortem. Endomizij je nedotaknjen in pritrjen na vlakna(Encyclopedia of meat sciences) 1 mm

35. Spremembe na perimiziju (puščica) post mortem goveje mišice Biceps femoris zorene 2 tedna Jasni sloji kolagena (posamezni sloji so označeni s črnimi linijami) v debelem sloju sekundarnega perimizija. Ni vidne separacije in perimizij je nedotaknjen. 2 mm Kolagen pri veliki povečavi (majhni sivi krogci). V nekaterih regijah je viden prostor med kolagenskimi fibrilami, kar kaže na rahle spremembe med skladiščenjem. Elastinska vlakna (bela puščica) so nespremenjena. 200 nm

36. Senzorične lastnosti • nekatere vrste in kosimesa zorijo hitreje in druge počasneje • pri višji temperaturi meso zori hitreje in narobe • meso starejšihživali in nižjihkakovostnih razredov zori počasneje • soljeno in dehidrirano (sušeno) meso zori zelo počasi

37. Senzorične lastnosti • mehkoba • če kuhamo mišico pred posmrtno otrplostjo, je navadno mehka • med razvojem otrplosti postaja zmerom bolj trda in je najtrša na višku otrplosti • po otrplosti se trdota zmanjšuje oz. meso mehča • mehčanje je hitro prve dni zorenja, kasnejepočasneje • v obsegu in hitrosti mehčanja so razlike med vrstami mesa: • goveje, jagnečje, telečje in kunčje meso se mehčajo približno enako hitro • svinjina hitreje • najhitreje piščančje meso (48 ur) • velike razlike med posameznimi mišicami (različna vsebnost veziva)

39. Senzorične lastnosti • mehkoba • nahitrost pomembno vpliva temperatura • 2 oC 10 do 14 dni • -1 oC6 do 8 tednov • hitrejše vse do 60 oC • 77oC 20 minut – popolna inaktivacija katepsinov • močna toplotna stabilnost teh encimskih sistemov • električno stimuliranje pospeši zorenje mesa • "hladno skrajšanje" upočasni zorenje

40. Mehčanje govedine napreduje s temperaturo zorenja (princip enak za vse mišice). pri 0oC je mehčanje zelo počasno hitrejše do 60oC potem se mehčanje zelo zmanjša obseg zorenja se močno zniža temperatura mesa med kuhanjem temperatura mesa v hladilnici

41. Povezava med rezno trdnostjo in povečevanjem temperature termične obdelave (1 h) (Bayley, 1988). pri temp. 40-50 oC pride do denaturacije mišičnih vlaken – meso postane trše pri temp. 65-75 oC pride do denaturacije perimizija in epimizija – zelo močno se poslabša mehkoba – torej je najprimernejša TO med 50-65 oC

42. Spremembe v aktivnosti kalpainov (najbrž odgovornih za zorenje mesa) so v povezavi s temperaturo mesa, pri kateri meso vstopi v rigor mortis. kalpaini so najbolj aktivni pri nevtralnem pH in temperaturo 15 oC nizek pH in visoke temperature inhibirajo aktivnost m-kalpaina

43. Spremembe v obsegu mehčanja mesa, ki so posledica stresa pred zakolom. Po 1 dnevu zorenja nizka in visoka vrednost pH povzročata mehko meso, meso z najprimernejšo vrednostjo pH je trše! Po 6-tem dnevu zorenja pri 10 oC vse meso postane mehkejše.

44. električna stimulacija kontrola 1 dan 14 dan 28 dan Primerjava električno stimulirane goveje najdaljše hrbtne mišice in kontrole med zorenjem(Hwang in Thompson, 2002)

45. Senzorične lastnosti • aroma in vonj • vplivajo isti dejavniki kot na mehkobo • obseg razvoja arome zrelega govejega mesa je manjši po hitrem kakor po počasnem zorenju • razvoj arome zrelega mesa je povezan: • s povečevanjem količine prostihaminokislin v mesu • sproščanjemželeza iz mioglobina in • s procesi na lipidni komponenti • sočnost • povečana sočnost pa je povezana s poslabšanjem SpVV med zorenjem oz. s povečanjem deleža nemobilne vode v zrelem mesu

46. Odbira mesa • mlada govedina • teletina • meso divjadi, drobnice in kuncev • normalna kakovost mišičnine Načeloma lahko zorimo vse kose mesa, vendar se za suhe toplotne postopke uporabljajo le mehki kosi: • file (pljučna pečenka) • ledja (šimbas) inbržola (hrbet) • križ (ramstek), notranje stegno manj pogosto pa: • zunanje stegno (črni krajec, beli krajec) • tanko in debelo pleče (odstranjene večje strukture veziva) • telečja rebra brez kosti, prsa in potrebušina

47. Priprava mesa • obrežemo • kos mesa - ena mišica brez veziva (stroj za odstranjevanje vezivnotkivne opne s kosov mesa) in ostalih delov • vakumsko pakiranje • počasen postopek zorenja - brez velikih temperaturnih nihanj • pospešeno zorenje: • mariniranje v mlečni kislini (lahko mešanici ocetne in mlečne kisline) • mehčanje mesa se pospeši, vendar se v okusu zazna kisla komponenta • ne razvije se polna zrelina (aroma) kakor med počasnim zorenjem

48. Vakuumsko pakirani kosi mlade govedine, pripravljeni za zorenje

49. Metode zorenja ZAKOL ŽIVALI (mlada pitana govedina, teletina) hlajenje od caa. 35 oC do 4 oC 3-4 dni RAZSEK IN PRIPRAVA KOSOV MESA ZA ZORENJE POSPEŠENO ZORENJE POČASNO ZORENJE • do 8 dni • T = 4 oC • 24-48 ur v kvaši in v olju • T = 20 oC dolgotrajno T = -1 do 0 oC do 8 tednov • običajno • T = 0 do 4 oC (2 oC) • mlada govedina • 10 do 14 dni • teletina • 4 do 6 dni

50. Odbijajoča vidna izceja zorenega junčjega fileja