Ricardo Molina Gasset Servicio de Análisis Clínicos Enero 2014

1. POLIMORFISMOS Y HEPATITIS C Ricardo Molina Gasset Servicio de Análisis Clínicos Enero 2014

2. El virus de la hepatitis C se secuenció por primera vez por Choo y colaboradores en 1989, al que llamaron VHC-1. • Pertenece a la familia Flaviviridae. • Está formado por ARN monocatenario con una envoltura lipoproteica con inserciones de las glicoproteínas E1 y E2.

3. Se replica en los hepatocitos con elevado número de mutaciones debido a la falta de actividad correctora de la polimerasa viral y su alta tasa de replicación. • En 1993 Simmonds y colaboradores clasifican al VHC en seis genotipos. • Estos genotipos se subdividen en subgrupos y cuasiespecies, atendiendo al grado de homología de sus secuencias. • Los genotipos son de gran importancia clínica: • No se asocia con la gravedad o progresión de la enfermedad. • Se asocia con la respuesta al tratamiento antiviral.

6. La hepatitis C se caracteriza por: • Enfermedad infecciosa muy prevalente en el mundo. • Grave problema de salud pública. • Primera causa de trasplante hepático. • Puede ser asintomática por lo que dificulta el diagnóstico precoz. • Curso variable: • Forma leve de pocas semanas de duración. • Forma más severa (crónica con cirrosis grave o incluso cáncer hepático). • Transmisión por vía parenteral (pacientes de hemodiálisis, usuarios de drogas inyectables, tatuajes, piercings, etc).

7. Epidemiología • Afecta a más de 170 millones de personas (2,5% de la población mundial) • La tasa de cronificación es del 70%: • 27% de los casos de cirrosis hepática • 25% de los carcinomas hepatocelulares • Mortalidad superior a 350.000 personas al año. • Gran variabilidad o heterogeneidad mundial debido a varios factores: • Diversidad de vías de transmisión en las diferentes zonas. • La disponibilidad y conocimiento de medidas preventivas • La prevalencia de esta infección: • En Europa 1.5% (unos 5 millones de personas) • Mayor prevalencia en Rumanía, Grecia, Italia (3%). • Menor prevalencia en el norte de Europa (0,4%-3%) • En España entre el 1,6 y el 2,6% • En Egipto el 9%, llegando hasta el 50% en zonas rurales.

9. IFN pegilado asociado a ribavirina Pacientes con hepatitis C crónica, tratados sin éxito con IFN en monoterapia • Resultados • Respuesta virológica sostenida en el 40-60% de los pacientes con genotipo 1 • Mejor respuesta bioquímica e histológica al tratamiento Tratamiento • Hasta 1998 el tratamiento de elección era la monoterapia con interferón (IFN). • Respuesta virológica sostenida (RVS) tras un año bajo tratamiento (15%). • Elevada tasa de pacientes no respondedores (50%). • Respuesta al tratamiento era transitoria (25%). • En 2001 la FDA aprueba una nueva formulación del IFN: Interferón pegilado Actualmente las guías de práctica clínica recomiendan como tratamiento de elección para los pacientes con hepatitis C la terapia combinada de interferón pegilado con ribavirina durante 48 semanas

10. Clasificación del tipo de respuesta al tratamiento con pegIFN-RBV: • No Respuesta (NR): se da cuando la carga viral RNA-VHC del paciente tras el tratamiento es detectable. • Respuesta Virológica Sostenida (RVS): cuando la carga viral RNA-VHC del paciente a las 24 semanas del tratamiento es indetectable. • Recidiva: pacientes que tras una RVS, en las 24 semanas siguientes la carga viral RNA VHC es detectable. • Caracteristicas del tratamiento estándar para el VHC: • Costoso • Gran abanico de efectos adversos • Por ello es útil disponer de factores que nos puedan ayudar en cuanto a la progresión de la enfermedad y respuesta a la terapia.

11. Factores del tratamiento • Régimen • Dosis y duración • Efectos adversos • Factores virales • Carga viral • Genotipo • Cuasiespecies Predictores de respuesta terapia Hepatitis C • Factores huésped • Edad • Sexo • Etnia • Alcohol • Resistencia Insulina • Fibrosis/Cirrosis • Adherencia • Genética

12. Factores predictivos de respuesta al tratamiento • Relacionados con el virus • Genotipo del VHC • Es el factor con mayor valor predictivo • Mejores tasas de RVS en 2 y 3 (82%), frente al 42% del genotipo 1. • Carga viral RNA-VHC • La presencia de una carga viral basal baja (menor de 800.000 UI/mL) • Relacionados con el huésped • Edad • Los pacientes menores de 45 años responden mejor al tratamiento. • Raza y sexo • Los africanos tienen tasas de RVS más bajas que los caucásicos. • Los varones presentan peor pronóstico de curación de la enfermedad.

13. Peso • El índice de masa corporal superior a 25 kg/m2 asociado a: • Tasa de RVS baja • Progresión de fibrosis mayor. • Cirrosis hepática • Con cirrosis hepática la RVS es más baja. • No se indica administrar terapia en cirrosis descompensada. • Resistencia insulínica • Uno de los efectos que causa el virus es la resistencia a la insulina. • Peor respuesta al tratamiento con IFN. • Índices HOMA > 4 asociados a una RVS del 20%, • Factores genéticos • Determinados polimorfismos genéticos parecen estar asociados a las respuesta al tratamiento.

14. Factores de RVS en la práctica clínica: • La respuesta viral rápida (RVR: ARN-VHC indetectable a la semana 4 del inicio del tratamiento) • Carga viral basal <600.000 UI/mL (5,8 log) • Raza no-negra • Ausencia de fibrosis

15. Factores genéticos • En 2009, Nature publica un artículo de Goldstein y colaboradores de asociación del genoma (GWAS) de más de 1.600 pacientes con infección crónica por VHC de genotipo 1. • Se examinan más de 550.000 polimorfismos. • Se identifica en el cromosoma 19 (19q13.13) un polimorfismo de la interleucina IL-28B, que se relaciona con la respuesta al tratamiento de IFN pegilado y ribavirina. • Los tres genotipos posibles de la IL-28B son: • C/C (mutado) • C/T (heterocigoto) • T/T (salvaje).

16. Hallazgos sobre la asociación del polimorfismo del IL-28B y el VHC • Goldstein et al (2009) • El polimorfismo de la IL-28B predice la respuesta al tratamiento con pegIFN-RBV. • Mejor respuesta al tratamiento en europeos con el genotipo C/C. • Se duplica la eliminación del virus respecto a los pacientes africanos. • Thomas DL et al (2009) • Estudia 1.006 pacientes americanos caucásicos y africanos con VHC. • Se triplica la eliminación del virus con genotipo C/C respecto a C/T y T/T. • Thompson et al (2010) • Estudio tres cohortes de pacientes: caucásicos, africanos e hispanos. • Muestran mejor respuesta viral rápida para el genotipo mutado en caucásicos, siendo menor en hispanos y aún menor en africanos.

17. Polimorfismo IL28B (rs 12979860 CC) se asocia con RVS 1628 pacientes HCV G1 Ge D, et al. Nature. 2009;461:399-401

18. Predictores de RVS con Interferón/Ribavirina Hispanos (n = 75) Afro Americanos (n = 191) Caucásicos (n = 871) Factores Asociados con RVS Odds Ratio (IC 95%) 7.3 4.2 Genotipo IL28B rs12979860 (CC vs TT) 3.0 6.1 5.1 HCV RNA Basal (< vs ≥ 600,000 IU/mL) 1.1 5.6 2.4 Fibrosis Basal (METAVIR F0-F2 vs F3-F4) 4.1 1.0 10.0 Ge D, et al. Nature. 2009;461:399-401.

19. En Europa predice la respuesta al tratamiento con Interferón/Ribavirina Prevalencia de Alelos IL28B Explicar variación geográfica en RVS Thomas DL, et al. Nature. 2009;461:798-802.

20. Papel del polimorfismo del IL28B en pacientes coinfectados • Pineda JA et al (2010) • El genotipo de la IL-28B es el mejor factor pronóstico de respuesta al tratamiento de la hepatitis C en los genotipos 1, 4 e incluso 3. • Rallon N et al (2010) • El polimorfismo de la IL28-B predice la RVS en pacientes con hepatitis C coinfectados por el VIH. • Guardiola et al (2011): • Los genotipos del IL28B presentados en los pacientes sanos y en los coinfectados fueron de distribución similar. • El genotipo C/C en los pacientes monoinfectados se hallaba con menor frecuencia. • En pacientes coinfectados la prevalencia C/C, fue el doble para el genotipo viral 3 frente al 1 y al 4.

21. Clausen et al (2012) • Mayor riesgo de mortalidad: • Carga viral alta en el genotipo 3. • Genotipo C/C del polimorfismo de la IL-28B. • Bermejo et al (2013) • Genotipo C/T o T/T marcador de respuesta deficiente al tratamiento. • Genotipo C/T o T/T efecto protector contra el daño hepático causado por el virus en pacientes coinfectados por el VIH. • Por ello, aún es necesaria la investigación en este grupo de pacientes, en los que un genotipo determinado puede favorecer la respuesta a la terapia y, sin embargo, influir negativamente en la progresión de la enfermedad.

22. Medrano et al(2010) • Plantean un Índice de predicción de RVS en los pacientes coinfectados. • Índice Prometheus (PI), variables en la ecuación : • La fibrosis hepática medida mediante FibroScan (en kilopascales). • El genotipo del VHC (1 y 4 frente a 2 y 3). • La carga viral del VHC (en UI/mL). • El polimorfismo rs12979860 de la IL28B (C/T ó T/T frente a C/C). • La fórmula del índice Prometheus es: • x= [13,940 + (-1,549 x genotipo 1 ó 4) + (-1,682 x log10 carga viral VHC) + (-0,084 x fibrosis) + (-1,772 x C/T o T/T)].

23. Se obtuvo un valor del área bajo la curva ROC de 0,89 en el grupo de pacientes, y de 0,85 en el grupo de validación. • Este índice permite evaluar la probabilidad de RVS. • Sería conveniente validar dicho índice en otras cohortes para reafirmar su eficacia pronóstica.

24. Lipoproteínas de baja densidad (LDL) como factor pronóstico de la respuesta al tratamiento • Clark et al (2012) • Indicios de que los niveles de LDL y los polimorfismos de la IL-28B estaban asociados con la RVS. • Los modelos de regresión multivariante para la RVS en pacientes heterozigotos C/T mostraron: • LDL > 130 mg/dL y Carga viral ≤ 600.000 UI/mL • LDL < 130 mg/dL o Carga viral >= 600.000 UI/mL RSV superior al 80% RSV inferior al 35% • Taura N et al (2012) • Concentraciones de colesterol total y de LDL elevados previos al tratamiento son pronósticos de mayores tasas de RVS, en genotipos virales 1 y 2.

25. La ribavirina(RBV) • Análogo sintético de guanosina. • Actividad antiviral "in vitro" frente a virus de ARN y de ADN. • En combinación con PegIFN tiene un efecto muy intenso frente al VHC tanto "in vitro" como "in vivo“. • Ejerce su acción a través de la inhibición directa de la replicación del virus, principalmente por: • Interfiere la síntesis celular de GTP. • Modulación del equilibrio entre Th1 y Th2 de la respuesta inmune del huésped.

27. El tratamiento combinado PegIFN+RBV se asocia a múltiples efectos adversos: • Anemia hemolítica por la RBV y la toxicidad medular del IFN. • La anemia hemolítica es reversible y dosis dependiente. • Requiriendo la reducción de la dosis en anemias severas. • Posible afectación de la eficacia de la terapia. • Retirada del tratamiento en el 10%-14% de los pacientes. • La reducción de Hb de 1,5 g/dL en las dos primeras semanas de tratamiento es predictiva del desarrollo de una anemia severa, de forma que requerían una intervención precoz mediante la reducción de la dosis de RBV.

28. Se han barajado múltiples factores de riesgo para la anemia: • Edad • Sexo femenino • Dosis y concentración plasmática de RBV • Hemoglobina basal • La gran variabilidad entre diferentes individuos, ha sugerido una posible asociación genética de este efecto adverso.

29. Fellay et al (2010) • Han detectado fuerte asociación entre la reducción de la concentración de hemoglobina tras 4 semanas de tratamiento y dos variantes deficitarias conocidas del gen ITPA que codifica la Inosina Trifosfatasa (cromosoma 20p13). • Variante rs1127354 (sustitución C/A en el exón 2) • Distribución alelos AA:0,4%, AC:10,9%, CC:88,7%. • Variante rs7270101 (sustitución A/C, alteración de "splicing" en el 2º intrón) • Distribución alelos AA:70,6%, AC:27.3%, CC:2,1%).

30. Thompson et al (2010) • A la cuarta semana de tratamiento el 45% de los pacientes con los alelos mayoritarios tuvieron una reducción >3 g/dL de Hb. • En ambos polimorfismos los alelos minoritarios se asocian con una reducción de la actividad Inosina Trifosfatasa (ITPasa). • Fuerte asociación entre la deficiencia de ITPasa y la menor frecuencia de hemólisis inducida por RBV tras el tratamiento completo de 48 semanas.

31. Globalmente estas variantes de protección se encuentran en aproximadamente 30% de la población. • Ambos SNP: • Variantes funcionales, responsables de la deficiencia de ITPasa. • Sin relevancia clínica aparente, que en los eritrocitos dan lugar a la acumulación de ITP (sustrato de ITPasa). • Aumento de la toxicidad de los fármacos análogos de las purinas.

32. Mecanismo: Deplección GTP por efecto del la RBV Agotamiento de los niveles de ATP en eritrocitos por deplección de GTP Anemia hemolítica Polimorfismos gen ITPasa. Acumulación de trifosfato de inosina (ITP) en los eritrocitos. El ITP puede ser utilizado en lugar del GTP, para la síntesis de ATP.

34. Conclusión: • En la práctica clínica la inclusión del estudio del genotipo ITPA en la valoración analítica del pretratamiento mejoraría la información : • Riesgo diferencial de la anemia inducida por RBV. • La frecuencia de estudio de la concentración de Hb y la necesidad de ajustar la dosis de RBV. • En pacientes con alelos de ITPA deficientes: • La reducción de las dosis de RBV es menos frecuente. • La reducción de las dosis de RBV es mas tardia. • Menor frecuencia de monitorización de la posible anemia. • Plantear tratamientos más agresivos para maximizar la RVS. • En pacientes con actividad normal de ITPasa • Vigilancia precoz y frecuente de las concentraciones de Hb.

35. Secuenciación directa El genotipado se realiza mediante secuenciación directa por el método de Sanger, después de la amplificación por PCR). Electroferograma de un paciente heterocigoto C/T

36. PCR a tiempo real • Análisis de curvas de fusión (High Resolution Melting curve) • Se emplea un fluorocromo de unión inespecífica a la doble hebra de ADN. • Permite identificar fragmentos amplificados concretos a partir de la temperatura de fusión. • Se visualizan las curvas de fusión para el polimorfismo de la IL-28B. • Se observan tres grupos de curvas en la figura: • Curvas rojas en el lado derecho indica C/C), • Curvas verdes en el lado izquierdo indica T/T • Curvas de color azul en el medio indica heterocigoto C/T

39. PCR mediante polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) • Inicialmente, mediante una PCR estándar se obtiene un producto de amplificación de 190 pares de bases de longitud. • Los productos amplificados se someten a una digestión enzimática mediante una endonucleasa de restricción diana (la Bsh1236I), la cual digiere en fragmentos el alelo C. • Los productos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa. • Posteriormente, se visualizan las bandas correspondientes bajo luz ultravioleta.

41. FIN