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LA SIFILIDE

LA SIFILIDE. “ He who knows syphilis knows medicine” Sir William Osler (1849-1919).

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LA SIFILIDE

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Presentation Transcript

  1. LA SIFILIDE “ He who knows syphilis knows medicine” Sir William Osler (1849-1919)

  2. La sifilide è una malattia infettiva trasmessa principalmente per via sessuale, causata dal Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio mobile spiraliforme appartenente all’Ordine Spirochetales, Famiglia Treponematacee. Il batterio filiforme, appare filamentoso ed avvolto a spirale e le sue Dimensioni in lunghezza sono nell’ordine di 5 mi- cron – 15 micron con un diametro trasverso tra 0,1 micron e 0,2 micron.

  3. Si moltiplica per scissione semplice con divisione trasversale ed al contrario di molti consimili della sua famiglia, per le sue particolari esigenze nutritive e metaboliche, non può essere coltivato in vitro o meglio può esserlo solo per breve tempo con un massimo sopravvivenza di 7 giorni a 35°, in terreno particolarmente arricchito ed in presenza di CO2. Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da trasfondere conservato nelle emoteche. In azoto liquido mantengono la loro vitalità, mentre proliferano in maniera eccellente nei testicoli di coniglio.

  4. Una patologia che viene da lontano….. nel tempo? Rothschild B.M. Existence of syphilis in a Pleistocene bear Nature. 335 (6191):595, 1988 Oct 13 Wright D.J. Syphilis and Neanderthal man Nature . 229 (5284):409, 1971 Feb 5

  5. …o nello spazio?

  6. LA CLINICA

  7. EVOLUZIONE NATURALE DELLA SIFILIDE Studio di Oslo 1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al 1941 sifilide I ---> sifilide II | latenza ---> 25% recidive | < 2 anni | sifilide latente tardiva (sifilide III)

  8. DEFINIZIONI Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla seguente classificazione: a) infezioni primarie e secondarie b) infezioni latenti recenti ( <2 anni) c) infezioni latenti tardive (>2 anni) d) infezioni tardive sintomatiche e) infezioni connatali in soggetti con meno di due anni f) infezioni connatali in soggetti con due anni o più Si definisce sifilide latente recente un’infezione diagnosticata sierologicamente, la cui durata non oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce sifilide latente tardiva.

  9. LATENZA Periodo di silenzio clinico caratterizzato dall’assenza di lesioni e/o sintomi compreso tra: • contagio e comparsa del sifiloma (1° latenzao incubazione) • regressione delle lesioni primarie e comparsa delle eruzioni cutanee secondarie (2° latenza o recente) • regressione delle eruzioni cutanee secondarie e comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee e/o sistemiche (3° latenza o tardiva)

  10. DIAGNOSI La diagnosi di sifilide si basa su: - clinica -anamnesi - laboratorio Sarebbe un grave errore trascurare anche uno solo dei tre elementi

  11. IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE L’OSSERVAZIONE DI UN ESSERE VIVENTE PUO’ AVVENIRE PER RICONOSCIMENTO DIRETTO…. O INDIRETTO….

  12. IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE DIAGNOSI DIRETTA Dimostrazione in sede di lesione della presenza del Treponema pallidum, indice certo di malattia DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICA Dimostrazione degli anticorpi anti Treponema pallidum, indice di infezione

  13. DIAGNOSI DIRETTAdimostrazione del Treponema pallidum • 1905: Identificazione del Tp al microscopio ottico (Schaudinn F & Hoffmann E) • 1907: Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio (Parodi U Giornale dell’Accademia Medica di Torino 13:288;1907 ) • 1909: Microscopia in campo oscuro (Coles) • 1948: Rabbit Infectivity Test (Magnuson) • 1964: Immunofluorescenza diretta (Yobs AR) • 1990: PCR (Hay)

  14. Diagnosi diretta del treponema • Cross section of a spirochete PF=periplasmic flagell OS=outer sheath TEM x60.000 IL Treponema pallidum, appartiene alla famiglia delle Treponematacee, batteri di forma elicoidale, mobili, a divisione trasversale. lunghezza variabile da 8 a 14 micron larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron.

  15. Treponema pallidum • Microscopia elettronica al Scansione (SEM) Microscopia elettronica a scansione (SEM) Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): spirocheta infiltrata nei tessuti

  16. Struttura antigenica La conoscenza antigenica del treponema pallido ha consentito l’uso di metodi diagnostici diretti specie specifici (DFA-TP) • Un antigene polisaccaridico • Un antigene lipidico • Un antigene proteico • Antigeni del corpo del treponema

  17. Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio Il treponema pallido non cresce in vitro ma può essere coltivato nel testicolo di coniglio e identificato su preparato istopatologico colorato con sali di argento Istopatologia: Treponema pallidum coltivato su testicolo di conoglio(whartin-Starry silver stain)

  18. 1909: Microscopia in campo oscuro Contrasto di fase: Questa tecnica si usa per evidenziare preparati trasparenti che non possono assorbire luce. Il preparato è reso visibile perchè viene contrastato con un'altra angolazione di luce e quindi canbiandogli il proprio indice di rifrazione. Campo oscuro: Viene inserito un disco opaco (chiamato “stop”) sul percorso della luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce illumina il soggetto e permette la risoluzione di dettagli fini. L’illuminazione è obliqua e entra nell’obiettivo solo se rifratta dall’oggetto osservato, il fondo rimane scuro.

  19. 1909: Microscopia in campo oscuro(PARABOLOIDE) La microscopia in campo oscuro è il metodo più veloce e diretto per diagnosticare la sifilide primaria e secondaria.  I campioni devono essere esaminati immediatamente dopo il prelievo da parte di personale addestrato al riconoscimento del Treponema pallidum.

  20. 1964: Immunofluorescenza diretta (DFA-TP) L’immunofluorescenza diretta mediante ab specifici (DFA-TP) può essere utilizzata per identipicare il T. pallidum.  I vantaggi di questa tecnica rispetto alla microscopia in campo oscuro è che lo striscio non deve essere esaminato subito ed è specie specifico. Richiede tuttavia attezzature specifiche e personale con esperienza. anticorpo monoclonale fluorescente diretto verso l’antigene lipoproteico di 47 kd. Courtesy of Sheila Lukehart

  21. Il genoma del Treponema p. è stato completamente sequenziato Fraser CM, Norris SJ, et al: Science 1998 Jul 17;281(5375):375-388 Il genoma di T. pallidum consiste di 1.138.006 paia di basi e contiene 1041 predicted open reading frames (ORF)

  22. BIOLOGIA MOLECOLARE La conoscenza della sequenza genomica e di alcune proteine specifiche da esso codificate ha consentito l’uso di indagini biomolecolari : • PCR x gene codificante proteina 47Kd sensibilità 10-50 spirochete • PCR x DNApolimerasi I sensibilità 10-50 spirochete • RT-PCR sensibilità 1 spirocheta

  23. Attendibilità diagnostica SENSIBILITÀ: amnios (100%), lesione mucose o cutanee esulcerate (96%), sangue (67%) liquor (60%) SPECIFICITÀ: lesione cutanea (96%), amnios e sangue(100%) LIMITI: Costi Incapacità distinguere TP vitali e tracce di TP morti Non indicato su liquor Tempi di esecuzione

  24. PCR x gene codificante proteina immunogena di membrana 47Kd • Zoechling N. et al 1997: PCR nested per il gene di una proteina di membrana immunogenica di 47 Kd----- banda 196 pb • H S Jethwa et al. J Clin Microbiol. 1995 January; 33(1): 180–183 ------banda 658pb • Karina A. Orle Et al 1996. Multiplex PCR Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes. AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system) colorimetric detection sistem

  25. PCR x gene codificante DNA polymerase I. Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B.New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene.J Clin Microbiol. 2001 May;39(5):1941-6. Sensibilità 95,8%; specificità 95.7% agarose gel electrophoresis of polA PCR from serial dilutions of known concentrations of T. pallidum DNA extract. (A) Primer set I. The arrow indicates a 377-bp product. (B) Primer set II. The arrow indicates a 395-bp product. Lanes 1, 2

  26. N.L. Treponema pallidum Kit • Estrazione mediante gel di silice • Banda specifica per Treponema p. 273 pb • Controllo interno 668pb Tempo di esecuzione: in giornata

  27. N. L. Treponema pallidum Kit • Estrazione mediante gel di silice • amplificazione

  28. N. L. Treponema pallidum Kit • Banda specifica per Treponema p. 273 pb • Controllo interno 668 pb 668 pb Controllo interno 273 pb Treponema

  29. Treponema pallidum PCRcasistica centro MST 1° Clinica Dermatologica Torino * 3 lesioni alla cervice uterina 3 solco balano-prepuziale ** roseola del tronco

  30. MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO sensibilità buona (80%) specificità buona operatore-dipendente risposta immediata labilità del campione economico adatto a qualsiasi laboratorio PCR sensibilità elevata (96%) specificità elevata operatore indipendente risposta in giornata invio dei campioni costo elevato laboratorio attrezzato Isolamento del Tp da lesioni muco-cutanee

  31. Indicazioni alla diagnosi diretta La dimostrazione del T. pallidum è raccomandata in: • sifilide primaria sieronegativa • sifilomi extragenitali (orale, anale) • Sifiloma cervicale • re-infezioni • coinfezione con HIV • Sifilide secondaria atipica E’ poco utile nelle forme secondarie e terziarie

  32. DIAGNOSI SIEROLOGICA:dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum • Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica solo una risposta immunitaria dell’ospite alla presenza del Treponema, presente o passata. • Non esiste un unico test sierologico che fornisca informazioni certe sullo stadio della malattia. • Solo l’esecuzione di più test in contemporanea associati alla clinica ci può permettere di definire l’esatto stadio.

  33. DIAGNOSI SIEROLOGICAdimostrazione di anticorpi anti T. pallidum • 1906:Reaz. di Wassermann • 1946: Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) • 1949: Treponema Pallidum Immobilisation (TPI) • 1956: Rapid Plasmin Reagin (RPR) • 1964: Fluorescence Treponemal Antibody-absorption (FTA-abs) • 1965: Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA) • 1975: ELISA • 1988: Western Blot

  34. CLASSIFICAZIONE DEI TEST NON-TREPONEMICI: VDRL (aspecifici) RPR Test TREPONEMICI : TPHA (specifici) FTA-abs ELISA/EIA Western Blot

  35. Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR) Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti contro lipidi di membrana del Treponema pallidum e contro lipidi serici presenti nell’ospite per il danneggiamento di membrane mitocondriali causato da diverse patologie. A questo scopo si utilizza la cardiolipina di bue che cross-reagisce con questi antigeni Pangborn MC. A new serologically active phospholipid from beef heart. Proc Soc Exp Biol Med. 1941;48:484. Harris, A., A. A. Rosenberg, and L. M. Riedel. 1946. A microflocculation test for syphilis using cardiolipin antigen. Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform. 27:169-174.

  36. VDRL Harris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio. 1948. The VDRL slide flocculation test for syphilis. II. A supplementary report. J. Ven. Dis. Inform. 29:72-75. Venereal Disease Research Laboratory. VDRL tests. In: Scheele L A. , editor; Scheele L A. , editor. Manual of serologic tests for syphilis. U.S. Washington, D.C: Government Printing Office; 1949. pp. 109–120. La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione del complemento, descritta per la prima volta da Wassermann, Neisser & Bruck, in 1906, conosciuta sotto il nome di reazione di Wassermann

  37. VDRL L’antigene VDRL, che è una miscela di cardiolipina, lecitina e colesterolo, è la base di tutti i test non treponemici. Con varie modificazioni l’antigene è stato stabilizzato per essere usato in altri test aggiungendo stabilizzatori e pigmenti: USR (unheated serum reagin test) con siero non scomplementato RPR (rapid plasma reagin test) con plasma non scomplementato TRUST (toluidine red unheated serum test) (TRUST) con siero non scomplementato e aggiunta di blu di toluidina. La velocità del test ha favorito l’RPR, ma la VDRL rimane l’unico test consigliato dalla FDA americana per diagnosticare la neurosifilide su liquor. Inoltre la VDRL rimane il test più economico e perciò è preferito nei laboratori con scarse disponibilità finanziarie (“paesi poveri”).

  38. VDRL Antigene: cardiolipina di bue + lecitina + colesterolo anticorpi del paziente flocculazione

  39. VDRL 1 inattivazione complemento 2 siero 4 agitazione 3 reattivo

  40. Tempo di esecuzione 45-50 minuti VDRL 5 lettura VDRL NEG VDRL POS

  41. RPR (Rapid Plasma Reagin) Portinoy J, Garson W, Smith Ca.Rapid plasma reagin test for syphilis.Public Health Rep. 1957 Sep;72(9):761-6. RPR e' un test non-treponemico di flocculazione per la determinazione qualitativa e semiquantitativa delle reagine (anticorpi) in siero o plasma Il test viene effettuato su siero o plasma. l'antigene è costituito da una sospensione colloidale di cardiolipina, lecitina e colesterolo miscelata a microparticelle di carbone. Quando un siero reattivo viene posto a contatto con l'antigene, si ha la formazione di una flocculazione macroscopica.

  42. RPR RPR è una variazione della tecnica standard VDRL, ha analoga specificità e sensibilità lievemente diversa offre i seguenti vantaggi: Reagente pronto all’uso Stabilità elevata Non è richiesta l’inattivazione del campione Può essere usato sia siero che plasma Lettura ad occhio nudo dei risultati. Svantaggi: non può essere usata su liquor

  43. Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR): pregi e difetti • test quantitativi, se titolati follow-up • alta sensibilità • basso costo ed esecuzione semplice e rapida • positivizzazione precoce (80% positivi nella Sifilide I) • negativizzazione entro 2 anni dalla terapia • variabilità d’interpretazione legata all’operatore • fenomeno prozona • bassa specificità (30% falsi positivi)

  44. TEST TREPONEMICI(TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB) • test qualitativi (TPPA e FTA titolo) • alta sensibilità (falsi neg eccezionali) • buona specificità (rari falsi pos) • positivizzazione variabile (IgM > FTA >TPPA) • negativizzazione assente (o molto tardiva) • costo variabile • tempi più lunghi, laboratorio attrezzato

  45. TPHA/TPPA TPHA (T. Pallidum HemAgglutination) TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination) Il TPHA, ideato nel 1965 è stato recentemente sostituito dal TPPA, più sensibile e utilizza particelle di gelatina al posto di emazie di pollo o altri volatili

  46. TPPA(T. Pallidum Particle Agglutination) antigeni treponemici particelle sensibilizzate Particelle di gelatina particelle sensibilizzate anticorpi del paziente agglutinazione

  47. TPHA/TPPA Tempo di esecuzione: circa 2h30’ 2 siero 1 tampone sorbent 3 particelle sensibilizzate e non 4 lettura

  48. TPHA/TPPA titolazione 2 siero

  49. FTA (Fluorescent Treponemal Antibody) Deacon WE, Falcone VH & Harris A.Fluorescent Test for Treponemal Antibodies.Proc. Soc. Exper. Biol. & Med.96: 477-489, 1957 FTA-abs Hunter Ef, Deacon We, Meyer Pe. An Improved Fta Test For Syphilis, The Absorption Procedure (Fta-abs). Public Health Rep. 1964 May;79:410-2.

  50. FTA IgG e IgM E’ il test storicamente usato per l’dentificazione delle IgM (lue congenita), oggi affiancato da ELISA e WB

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