Sesarini C 1 , Giménez ML 2 , Redal M 1 , Argibay P 1 , Otaño L 2 .

1. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno. Sesarini C1, Giménez ML2, Redal M1, Argibay P1, Otaño L2. (1) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME (2) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia Hospital Italiano de Buenos Aires

2. Introducción Diagnóstico prenatal No invasivo

3. Introducción Aplicaciones

4. Introducción Genotipificación del Rh fetal Mujeres Rh (-) con Pareja Rh (+) heterocigota Pacientes no sensibilizadas Uso eficiente de la gammaglobulina - Escasa - Costosa - Exposición innecesaria a hemoderivados Pacientes sensibilizadas Asesoramiento precoz Evitar procedimientos invasivos - Riesgo de pérdida - Mayor sensibilización

5. Introducción Determinación del sexo fetal • El diagnóstico de sexo genético prenatal requiere la extracción de material del embarazo. • El análisis de ADN fetal en sangre materna permitiría evitar estos procedimientos y mejoraría el manejo perinatal de patologías como: - enfermedades ligadas al cromosoma X - virilización en HSC - malformaciones que afectan selectivamente a un sexo

6. Identificar y analizar marcadores de ácidos nucleicos fetales libres en sangre de embarazadas con el objeto de desarrollar un método no invasivo de diagnóstico prenatal de condiciones genéticas fetales y de patologías del embarazo con impacto sobre la salud materno-fetal. Objetivo General

7. Evaluar la factibilidad y la eficacia diagnóstica de la determinación del genotipo RHD fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas Rh (-) • Evaluar la factibilidad y la performance del diagnóstico de sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma materno. Objetivos

8. Materiales y Métodos • Extracción de sangre (5 ml) de 60 embarazadas Rh (-), previa firma del consentimiento informado. • Edad gestacional media: 27 semanas (rango: 7 a 41) • Separación del plasma y extracción de ADN • - Vi: 1000 μl • - Vf: 40 μl • Real Time-PCR: amplificación de una secuencia del gen RHD exón 7 (125 pb), marcador DYS14 del cromosoma Y (84 pb) y β-Actina (88 pb).

9. Resultados RhD positivo RhD negativo • Sexo masculino • Sexo femenino • Se calculó - sensibilidad • - especificidad • - valor predictivo • - exactitud de la prueba Materiales y Métodos

10. Curva de Amplificación gen RH Electroforesis (gel de agarosa) de productos de amplificación. 125 pb 1: Ladder; 2-3: Feto Rh (+), duplicados; 4-5: Feto Rh (-), duplicados; 6: Control Rh (+); 7: Control Rh (-); 8: Agua Resultados

11. Resultados Análisis del gen RHD en plasma materno y Rh del RN Exactitud: 86,70% (52/60) Sensibilidad: 94,30% (33/35) Especificidad: 76,00% (19/25) Valor predictivo de RhD positivo: 84,60% (33/39) Valor predictivo de RhD negativo: 94,50% (19/21)

12. Resultados Uso de Gammaglobulina Anti Rh D en base al resultado del análisis del ADN Fetal Embarazadas RhD negativas n: 60 Fetos RhD positivos n: 35 Fetos RhD negativos n: 25 Test positivo n: 33 Test falso negativo n: 2 Test falso positivo n: 6 Test negativo n: 19 ɣ-globulina No se aplicaría tratamiento necesario Ahorro de ɣ-globulina ɣ-globulina innecesario

13. Resultados Curva de aprendizaje de genotipificación RHD

14. Resultados Análisis del marcador DYS14 en plasma materno y sexo fenotípico del RN. Exactitud: 95,00% (57/60) Sensibilidad: 97,44% (38/39) Especificidad: 90,48% (19/21) Valor predictivo sexo masculino: 95,00% (38/40) Valor predictivo sexo femenino: 95,00% (19/20)

15. Resultados Curva de aprendizaje de la determinación del sexo fetal

16. Discusión • La amplificación de secuencias (RHD y DYS14) en embarazadas demuestra la factibilidad de realizar un diagnóstico prenatal no invasivo del Rh y sexo fetal a partir del análisis de ADN fetal en plasma materno. • La determinación del Rh fetal en madres Rh (-) fue factible en la mayoría de los casos; exactitud 86,70% • Problemas diagnósticos: • - Primera etapa de la serie • Falsos positivo (6) sin riesgo en la práctica clínica  contaminación, “vanishing twin” o variantes alélicas. • Falsos negativo (2) baja concentración de ADN fetal

17. Discusión • La asignación del sexo fetal se predijo correctamente en 57 de 60 embarazos evaluados (95%). • Problemas diagnósticos: • - Primera etapa de la serie • - Falsos positivo (2): contaminación, “vanishing twin” • - Falso negativo (1): baja concentración de ADN fetal • Se han detectado secuencias de ARN fetal libre en plasma materno (Poon et al. 2000) • Detección de secuencias de expresión placentaria (gen PLAC4, cromosoma 21) permitiría cuantificar niveles de expresión y podrían utilizarse para medir ploidía (Lo et al. 2007)

18. Conclusión • Aplicación en práctica clínica: mujeres Rh (-) no sensibilizadas limitaría profilaxis a fetos Rh (+) y sensibilizadas permitiría asesoramiento más preciso, realizando estudios invasivos sólo en embarazos con fetos Rh (+) • La determinación del sexo fetal a partir de la semana 7 permitiría el manejo temprano de embarazos en riesgo de ciertas patologías. • La inclusión de otra secuencia del gen RHD (exón 5) y del cromosoma Y (gen SRY), permitirán aumentar la especificidad del método. • Desafíos diagnósticos: evaluación diferenciada de ácidos nucleicos fetales de maternos y evaluación de ploidía.

19. Gracias por su atención.

20. Bibliografía • Poon LL, Leung TN, Lau TK & Lo YM. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem 2000; 46: 1832-1834. • Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Heung MM, Gerovassili A, Jin Y, Nicolaides KH, Cantor CR & Ding C. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med 2007; 13: 218-223. • Hahn S & Chitty LS. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and future perspectives. Curr Opin Obstet Gynecol 2008; 20: 146-151.