HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO

11. lekcija HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO

11. lekcija 11.1. Haploīdu augu iegūšana in vitroHaploīdus augus, t.i., augus ar pusi no taksonam raksturīgā hromosomu komplekta, var iegūt no ģeneratīvajām šūnām – vēl nenobriedušiem putekšņiem, putekšnīcas, olšūnas un ovārija.

11. lekcija Haploīdu augu iegūšanai ir liela nozīme ģenētikā un selekcijā,jo no haploīdiem ir vieglāk izdalīt un atlasīt vērtīgas mutācijas, bet ar kolhicīna palīdzību var iegūt pilnībā homozigotus diploīdus augus.

11. lekcija Izolējot olšūnas vai putekšņus ar ieprogrammētu gametu izveidošanu, audu kultūrās tie pārslēdzās uz tādiem procesiem, kas raksturīgi somatiskajām šūnām.

11. lekcija 11.1.1. Putekšņu un putekšnīcu kultūrasPirmo reizi par haploīdu audu iegūšanu no putekšnīcām ar sekojošu haploīdu audu reģenerāciju ziņoja Guha un Maheshwari 1964.gadā ar Datura innoxia. Metodi tālāk pilnveidoja Bourgin un Nitsch, kas 1967.gadā publicēja darba rezultātus par haploīdas tabakas iegūšanu un pavairošanu.

11. lekcija Haploīdus augus, piemēram, no putekšņiem var iegūt divos veidos:izraisot putekšņu dalīšanos un inducējot embrioģenēzi,inducējot kallusa veidošanos un tajā savukārt izraisot organoģenēzi.

11. lekcija Abos gadījumos tas notiek pilnīgi atšķirīgi no normāliem procesiem in vivo. Pēc 1-2 dalīšanās reizēm gametu veidošanās tiek bloķēta, un tālāk tā iziet it kā somatiskās šūnas stadiju, bet tālāk šī šūna dalās kā zigota, no kuras veidojas embrijs.

11. lekcija Vēlamāks ir tiešās androģenēzes ceļš, kurā mikrospora it kā pārtop par zigotu un iziet veselu rindu embrioģenēzes etapu;uz putekšnīcas var veidoties pat vesels audziņš – haploīds reģenerants. Šis tiešais ceļš, piemēram, aprakstīts četrās Solanaceae dzimtas ģintīs – Datura, Nicotiana, Atropa un Lycium.

11. lekcija 11.1.1.1. Putekšnīcu kultūrasAndroģenēzes sekmīga indukcija ir lielā mērā atkarīga no putekšņu stāvokļa, ievadot in vitro. Lai iegūtu haploīdus audus, rekomendē putekšņus ievadīt sterilā kultūrā putekšņu pirmās mitozes laikā vai tūlīt pēc tam. Kā izejmateriāls ir derīgi neatvērušies ziedpumpuri ar putekšnīcām, kas satur vienšūnas mikrosporas.

11. lekcija Reinert un Bajaj (1977) apraksta šādu metodiku:Ziedpumpurus atdala un ievieto 2,5-5% Ca hipohlorīta šķīdumā uz 5-10 minūtēm, tad skalo sterilā destilētā ūdenī. Ziedpumpuru ar skalpeli atver, un, lietojot pinceti ar tieviem galiem, savāc putekšnīcas un ievieto sterilā Petri platītē. Tur atdala putekšņu maciņus un pārvieto tos mēģenēs vai mazās Petri platītēs ar barotni. Ja putekšņu maciņi ir sīki, tad darbu veic, skatoties caur lupu.

11. lekcija Nekādā gadījumā nedrīkst eksplantu ievainot; bojātos objektus nestāda, bet atmet.Pretējā gadījumā vai nu eksplants iet bojā, vai arī sāk veidoties kalluss nevis no putekšņiem, bet no somatiskām diploīdām šūnām.

11. lekcija Kultūru var ievietot arī šķidrā barotnē Erlenmeijera kolbās kratītājā ar nelielu kustībās ātrumu pa apli. Kultūru inkubē 24º-27º C un 14 stundu apgaismojumā ar gaismas intensitāti ~ 2000 lux.

11. lekcija Svarīgi, lai eksplanti būtu ņemti no relatīvi jauniem augiem, kas auguši normālā apgaismojumā. Veciem augiem ziedēšanas beigās veidojas sīki pumpuri, kam putekšnīcas satur nekvalitatīvas mikrosporas, tās var būt ar defektiem.

11. lekcija Lai no putekšņiem in vitro veidotos reģenerants, nepieciešamas vismaz 3-8 nedēļas. Sunderland (1973) rekomendē jaunveidojušos sīkos audziņus atdalīt tūlīt atsevišķi un pārstādīt uz jaunas barotnes.

11. lekcija Putekšnīcu kultivēšanai bieži izmanto kādu no trim barotnēm:White, 1943 (Ephedra, Ginkgo, Taxus, Torreya, Lolium, Hordeum, Lycopesicum),Murashige, Skoog, 1962 (Nicotiana),Nitsch, Nitsch, 1969 (Datura, Brassica).

11. lekcija Liela nozīme šīm kultūrām ir cukuriem un dzelzij. Parasti izmanto 2-4% saharozi, bet dažām kultūrām, kā, piemēram, miežiem, kviešiem un tomātiem, lieto stipri augstākas koncentrācijas – 6-12%.

11. lekcija Interesanti ir dati par fitohormonu pielietošanu šīm kultūrām. Androģenēze dažiem Nicotiana taksoniem un Atropa beladonna noris bez fitohormonu klātbūtnes; bet ja barotnei pievieno fitohormonus, tad tiek inducēta somatisko šūnu dalīšanās, kā rezultātā veidojas kalluss, kas sastāv no šūnām ar dažādu ploiditāti.

11. lekcija Datura putekšnīcu kultūrā embrioģenēze no putekšņiem tiek inducēta tikai ar kinetīnu, kurpretī auksīnu u.c. fizioloģiski aktīvo savienojumu pievienošana izraisa putekšnīcas diploīdo audu pavairošanos (Reinert, Bajaj, 1977).

11. lekcija Ar Brassica oleracea, B. oleracea x B.alboglabra un Orysa sativaiegūti pretēji dati – embrioģenēzes izraisīšanai putekšņu kultūrā bija nepieciešams tieši auksīns (Vasil, 1973).

11. lekcija Gemesne Juhasz u.c. (2001) darbā ar saldiem pipariem Capsicum annuum L. no putekšnīcām ieguvuši haploīdus (n – 12). Tālākajā darbā autori ieguvuši gan spontānos dihaploīdus (2n – 24), gan ar kolhicīnu inducētos dihaploīdus (2n·) – DH.

11. lekcija Gametoklonālie varianti veidojas meijozē. No putekšnīcām izveidotās DH- līnijas ir visvairāk piemērotie inbrīdi, piemēram, saldo piparu kultūru hibrīdu attīstībai, jaunu šķirņu veidošanai ar jaunu augļu formu, izmēru, krāsu u.c., kā arī rezistences veidošanai, īpaši pret vīrusu, tādu kā tabakas mozaīkas vīruss un baktērija Xantomonas vesicatoria.

11. lekcija Lai veidotos dubultie haploīdi, ungāru zinātnieki haploīdos reģenerantus ievietoja uz 4-6 dienām barotnē, kas saturēja 50-400 mg.L-1 kolhicīna. Bet rezultāti parādīja, ka ģenētiskās izmaiņas, kas veidojas kolhicīna inducēto genomu duplikācijā, nav vairāk, kā izmaiņas, ko izsauc meijotiskās rekombinācijas.

11. lekcija 11.1.1.2. Putekšņu kultūrasŠai metodei ir vairākas priekšrocības, salīdzinot ar putekšnīcu kultūrām: šīs kultūras attīstību nebremzē putekšnīcā atrodošies inhibitori,nav konkurences starp putekšņu un somatisko šūnu augšanu un vairošanos.Savukārt putekšņu kultūras mīnuss ir grūtības izraisīt putekšņu pirmo dalīšanos in vitro.

11. lekcija Sākotnēji androģenēzi putekšņu kultūrā izdevās izraisīt, izmantojot audus-“aukli” (līdzīgas metodes aprakstu skat. 9. lekcijā!). Zināmi panākumi kultivēšanā sasniegti, speciāli apstrādājot ziedpumpurus 2-5 dienas pirms eksplantu noņemšanas. Viens no tādiem paņēmieniem ir ziedpumpuru atdalīšana no auga 3 dienas pirms sterilās kultūras uzsākšanas, un pumpuru uzglabāšana pazeminātā temperatūrā (5º C).

11. lekcija Ir iegūti arī dati, ka androģenēzes iniciācijai dažiem augiem ir svarīgs eksogēni pievienots auksīns barotnei. Mikrosporu augšana un attīstība var noritēt arī tad, ja mikrosporas apstrādā ar 0,04-0,05% kolhicīnu. Bet tādā gadījumā, protams, hromosomu skaits divkāršojas, un tiek iegūtas homozigotas diploīdas šūnas, kas var dot pirmsākumu fertiliem augiem.

11. lekcija Putekšņu kultivēšana pēc Nitsch metodes (1977) Vispirms sterilizē neatvērušos pumpurus. Putekšņiem ir jābūt pirmās mitozes etapā. To pārbauda, krāsojot putekšņus ar acetokarmīnu vai Šiffa reaktīvu. Tūlīt pēc ziedpumpuru atdalīšanas tos centrifugē pusstundu ar 2000 apgriezieniem minūtē un 5-10º C temperatūrā.

11. lekcija Tālāk tos saglabā pazeminātā temperatūrā un mitrumā 48 stundas.Lai iegūtu homozigotus diploīdus augus, ziedpumpurus 24 stundas tur 2%-īgā dimetilsulfoksīdā izšķīdinātā 0,04%-īgā kolhicīnā vakuumā un pazeminātā temperatūrā.

11. lekcija Pēc 24 stundām kolhicīnu atmazgā, un pumpurus vēl patur aukstumā un mitrumā.Datura ziedpumpuriem, piemēram, šis nepieciešamais laiks bija 48 stundas; pēc tam varēja izolēt putekšnīcas, Nicotiana un labībai vajadzēja 3 diennaktis. Izolētās putekšnīcas uz 72 stundām ievietoja Halperina barotnē ar 2% saharozi un 5 mg.L-1 Fe-EDTA (pH 5,8) tā, lai uz katras putekšnīcas būtu 5 ml barotnes.

11. lekcija Putekšnīcas uzmanīgi pārspiež, piemēram, ar stikla irbulīti, un putekšņus atdala, filtrējot caur sterilu neilona sietu.Sieta poru diametram Datura kultūrai jābūt 40 µm, tomātiem – 25 µm, kukurūzai – 100 µm, utt. Suspensiju ar putekšņiem pēc tam centrifugē 5 minūtes ar 500-800 apgriezieniem minūtē.

11. lekcija Putekšņus pārvieto svaigā barotnē, ko vairākas reizes nomaina, resp., kultūru skalo, lai atbrīvotos no inhibitoriem, un lai mikrosporas varētu augt un attīstīties. Attiecībām jābūt tādām, lai 1 ml barotnē būtu 103 – 104 putekšņi.

11. lekcija Kultivēšanu veic Petri platītēs, pie kam šķīduma slānim ir jābūt plānam, lai nodrošinātu kultūras aerāciju. Kultivēšana jāveic 27-30 C vājā apgaismojumā vai arī sarkanā gaismā. Mikrosporas labāk kultivēt šķidrā barotnē, bet var izmantot arī “mīkstu” agarizētu barotni.

11. lekcija Jaunie embriji var veidoties barotnē apmēram pēc mēneša.Barotni putekšņiem izmanto vienkāršu, bet embriju attīstībai vajag citu, sarežģītāku barotnes sastāvu. Kā svarīgas sastāvdaļas tiek minētimezoinozīts, glutamīns un serīns.

11. lekcija 11.1.2. Olšūnu un ovāriju kultūrasLīdzīga pieeja kā putekšņu un putekšnīcu kultūrām ir arī olšūnu un ovāriju kultūrām.Kā piemēru var minēt M.Sitbon (1981) publikāciju. Autora uzdevums bijis iegūt haploīdus augus no vairākām Gerbera jamesonii šķirnēm.

11. lekcija Ziedu kurvīšus noņēma rudenī. Eksplantu izolēšanai izmantoja 4 malējos riņķus ar mēlziediem. Kultūrā tika ievadītas neapaugļotas olšūnas. Kalluss veidojās no olšūnu iekšpuses, savukārt no šā kallusa iegūti dzinumi. Šādā veidā tika iegūti vairāk nekā 10 dzinumi no viena eksplanta.

11. lekcija 11.1.3. Haploīdu iegūšanas jēgaHaploīdie augi, kas iegūti no putekšņu vai putekšnīcu kultūrām, ir sterili un nedod sēklas. No šiem augiem var iegūt homozigotus diploīdus.

11. lekcija Metodes būtība irpirmkārt, spēja veidot monoploīdu augu ar vienu hromosomu kompektu,otrkārt, veidot homozigotas, dubulti haploīdas tīras līnijas (DH) un,treškārt, iegūt meijotiskus rekombinantus ar unikālu genoma veidojumu (Caranta et al., 1996).

11. lekcija Kāpēc, piemēram, gerberai ir izdevīgi iegūt šādus DH augus?Gerbera ir ļoti viegli pavairojama ar sēklām, taču šādā veidā šķirņu īpašības nesaglabājas. Savukārt pavairošana ar spraudeņiem nav tik efektīva un ir sarežģītāka, jo speciāli ir jāsagatavo mātes augi.

11. lekcija Gerberu šķirnes mēs pavairojam ar audu kultūru metodi, bet ar sēklām tas būtu krietni lētāk. Tad, lūk, iegūstot kādas šķirnes haploīdu un no tā savukārt monozigotu diploīdu jeb DH, to iespējams pavairot arī ar sēklām. Tas būtu viens no piemēriem.

11. lekcija Haploīdus augus izmanto arī atlasei pēc noteiktām īpašībām, teiksim, pēc izturības pret herbicīdiem. Apskatīsim shēmu, ko attēlojis Chaleff (1983). Tajā shematiski attēlotas galvenās darbības pozitīvo mutantu atlasei augu audu kultūrās. Mutaģenēze palielina ģenētisko variabilitāti šūnu populācijā.

11. lekcija Inkubācija sākumā neselektīvos apstākļos ir svarīga, lai dotu iespēju eksperimentos inducēto mutantu gēnu ekspresijai. Tālāk šūnas tiek pārstādītas herbicīdu saturošā barotnē, lai atlasītu šūnas, kas ir rezistentas pret šo herbicīdu. Un nobeigumā Chaleff veicis diploidizāciju vai nu ar ķīmisku reaģentu palīdzību, vai notikusi spontāna diploidizācija, kā rezultātā iegūts DH augs, kas spējīgs veidot fertilas sēklas.

11. lekcija Chaleff shēma

11. lekcija 11.2. Poliploidizācija in vitroPoliploidizācijas izraisīšana dod iespēju krāšņumaugu selekcionāriem iegūt parasti lielākus vai arī pildītus ziedus.

11. lekcija Konkrēti rododendriem poliploidizācija bija devusilielākus ziedus, ilgāku ziedēšanas laiku un tumšākas krāsas,dubultojoties hromosomām (Väinölä et al, 2001).

11. lekcija Minētie somu zinātnieki pielietojuši kolhicīnu un orizalīnu (oryzalin).Viņi secinājuši, ka orizalīnā bijusi sliktāka izdzīvotība nekā kolhicīnā, bet tetraploīdu skaits – lielāks. Kopumā kolhicīns 0,05% koncentrācijā un orizalīns 0,005% koncentrācijā ar ekspozīcijas laiku 48 stundas devuši rododendru kloniem~ 12% tetraploīdu.Šeit tomēr jāpiebilst, ka diploīdo klonu lapas eksperimentos uzrādīja labāku izdzīvotību aukstumā nekā tetraploīdo.

11. lekcija 11.3. Daži svarīgi aspekti selekcijā in vitroAr šķirnēm diemžēl ir tā, ka augi ar krāšņākiem ziediem un lielākiem un saldākiem augļiem mēdz būt neizturīgāki pret dažādiem ekoloģiskiem apstākļiem, piemēram, krāšņās lilijas (Orientālā grupa) pret pastiprinātu nokrišņu daudzumu, minētie rododendri pret ziemas apstākļiem (sals, temperatūras svārstības), utt.

11. lekcija Tādēļ arī Rietumeiropā un Amerikā parādījies jauns virziens selekcijā: atzīto kultūras šķirņu krustošana ar sugām, kas ir dabā, kā arī vecajām šķirnēm (lai “uzlasītu” pazaudētos gēnus).

11. lekcija 2000.g. simpozijā Somijā, kas bija veltīts jaunām selekcijas metodēm in vitro, Kanādas zinātnieki iepazīstināja ar plašu zemeņu selekcijas darbu šajā virzienā. Viņiem norit sadarbība ar individuāliem fermeriem, kam nosacīti izolētos apstākļos ir lielas lauku platības ar zemeņu sugu kolekciju.

11. lekcija Savukārt EUCARPIA simpozijā Beļģijā 2001.g. tika stāstīts par modernu rožu selekcijas virzienu, mēģinot iekrustot dažādas sugas rozes, kā arī 19. un 20. sākumā veidotās šķirnes. Tad ir jāsaka, ka Latvijas selekcionāre Dzidra Rieksta Nacionālajā botāniskajā dārzā Salaspilī ar šādu rožu selekcijas virzienu darbojas jau no 20.gs. 60.-ajiem gadiem un ir ieguvusi tādas parka rožu šķirnes, kādas ārzemnieki cenšas iegūt tikai tagad.

11. lekcija Dzidras Riekstas selekcionētā rožu šķirne ‘ĀBEĻZIEDS’

11. lekcija Kāpēc šāds darba virziens?Apskatīsim šo pašu piemēru par parka rozēm. It kā tās nebūtu tik krāšņiem ziediem kā tējhibrīdrozes, bet āra apstākļos tās veido kompaktu krūmu ar vienmērīgu zarojumu un lapojumu, ziedi bagātīgi noklāj krūmu, un Dz. Riekstas veidotās šķirnes mūsu mainīgajās ziemās pārziemo bez segšanas.

HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO