1 mL de préculture de MH20-22B

1. 1 mL de préculture de MH20-22B Mesure de la DO à 600 nm au temps 0 ,0,5 ,1 ,1,5 ,2 ,2,5 ,3 3,5 ,4 ,4,5 ,5 ,5,5 ,6 ,24 ,48 , et 72H Prélever stérilement 2mL de cette culture au temps 0,3,6,24,48, et 72H 49mL de milieu CGXIII + 30 mmol.L-1 Centrifuger à 5000 x g pendant 10 minutes Mise en culture a 30°C à 104 rotation.min-1 pendant 72H Récupérer le surnagent Dosage des sucres réducteurs Dosage des acides aminés Préparation de la solution étalon de glucose à 10 mM Préparation de la solution étalon de Lysine à 0,002M Effectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai (en suivant la procédure ci-dessous Effectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai Effectuer une gamme étalon de 0 à 0,4 µmol de glucose Effectuer une gamme étalon de 0 à 10 µmol de glucose (en suivant la procédure ci-dessous) Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement -Effectuer une dilution approprié -ajouter 0,2ml de substrat distillé -ajouter 3,8 mL de réactif ninhydrine -mélanger -15 min au bain-marie bouillant -refroidir -mesurer l’absorbance à 570 nm Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement -ajouter la prise d ’essai -ajouter de l’eau distillée qsp 1mL -ajouter 2 mL de DNS -Mélanger -5 min au bain –marie bouillant -refroidir -ajouter 6mL d’eau distillée -mesurer l’absorbance à 530 nm

2. Ensemencement avec la souche sauvage Ensemencement avec la souche Modifiée Lac Z CGXIII CGXIII + Théobromine LB CGXIII CGXIII + leucine LB Mise en culture pendant 8 heures à 30°C avec agitation à 90 tours minutes Préparer 25 mL de la solution de tampon Z : Na2HPO4 60mM NaH2PO4 30mM KCL 40mM MgSO4.7H2O 1mM Ajuster à pH 7 β-mercaptoéthanol 50mM Préparer 10 mL de solution de Na2CO3 1M -Pour chaque échantillon faire trois prises d’essai Plus un blanc avec du tampon Z -diluer la prise d’essai avec du tampon Z qsp 1mL -ajouter 10µL de SDS 0,1% et 20 µL de Chloroforme sous la hotte (vortexer 15 secondes) -attendre 5 minutes. -ajouter 0,2 mL d’ONPG 4mg/mL ATTENTION noter l’heure de l’ajout -Lorsqu’une coloration jaune –paille apparaît, stopper la réaction en ajoutant 0,5 mL de solution de Na2CO3 1M ATTENTION noter l’heure de l’ajout -mesurer l’absorbance à 420 nm contre le blanc, et à 550 nm contre le blanc