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第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)

第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE). 蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程. 1. 蛋白质组分析的技术路线. 要求 流程 技术路线. 蛋白质组分析的首要要求. 　　将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。. 生物学问题的提出. 实验模型的设计. 实验组和对照组样品的制备. 蛋白样品的 IEF 和 PAGE 电泳分离. 感兴趣蛋白点的切取. 图像扫描和初步分析. 蛋 白 质 组 分 析 流 程. 胰酶对脱色后蛋白质的消化. 蛋白信息的初步获得.

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第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)

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  1. 第五章 双向凝胶电泳(2D-PAGE) 蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程

  2. 1. 蛋白质组分析的技术路线 • 要求 • 流程 • 技术路线

  3. 蛋白质组分析的首要要求 　　将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。

  4. 生物学问题的提出 实验模型的设计 实验组和对照组样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 感兴趣蛋白点的切取 图像扫描和初步分析 蛋 白 质 组 分 析 流 程 胰酶对脱色后蛋白质的消化 蛋白信息的初步获得 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 其它实验的进一步验证 新蛋白质的发现

  5. 蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备 双向电泳 图像分析 凝胶中的蛋白 转印至膜上的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 N端测序 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定

  6. 2. 双向电泳技术的发展及原理 • 双向凝胶电泳的发展 • 双向凝胶电泳的基本原理

  7. 双向凝胶电泳的发展 　　双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 　　随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 　　同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。

  8. 20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。 1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。 　　此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质点。

  9. 双向凝胶电泳的基本原理 　　先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。 　　第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点pH区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样，如果蛋白质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区域内。目前常使用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。 　　第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。

  10. 三种双向凝胶等电聚焦系统 　　根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：ISO-DALT、NEPHGE和IPG-DALT。 　　在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶 (tube gel) 中进行，载体两性电解质 (carrier ampholyte) 在外加电场的作用下形成pH梯度，pH梯度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到10000个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。 NEPHGE为非平衡pH梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是IPG (immobilized pH gradient) 胶发明前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。 IPG-DALT的第一向电泳是采用1982年发明的IPG胶 (Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradient: principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods, 1982, 6: 317-339)，其pH梯度的形成依赖于不同pK值的一种合成的化合物immobiline，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，IPG胶的pH梯度是稳定的，不依赖于外加电场，基本上克服了ISO-DALT的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于ISO-DALT。

  11. 双向电泳的分类 • 非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； • 非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2% SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用。 • 非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素 + 5%β-ME + 2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAGE电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 • 变性2D-PAGE：样品先用2%SDS + 5%β-ME + 95℃变性5min, IEF在8M尿素 + 1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS + 5%β-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质点少于第三种方式。

  12. 第一向： 　　采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为10, 000伏；有不同的电压上升方式；可分步进行时间或电压·小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦24根7cm，12根17cm胶条；有三个预设程序的方法；有十个用户自定方法；采集运行数据可经RS232端口输出或任何热敏打印纸。 3. 仪器简介 BIO-RAD公司PROTEAN IEF Cell 等电聚焦仪： Amersham pharmcia Biotech公司IPGphor等电聚焦仪： 　　电极区域为铜镀金板；最多上12个样品；平台温度为18-25℃±1℃；胶条槽 (Holder) 体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合7、11、13和18cm的胶条；程序参数包括重泡胀时间、平台温度、每根胶条的最大限流、每步的电压、每步的电流改变模式、每步的时间；可编辑10个程序，每个程序分有九个步骤；电压输出最大为8000V；最大电流为1.5mA；最大功率为12W。

  13. BIO-RAD公司PROTEAN II xi Cell电泳槽： 　　电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于16.5×20cm 凝胶电泳；凝胶厚度为1.0mm；可同时运行1-2块胶；上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液1.2 L；典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为5小时，带冷却时为3.5小时。配套电源为Power Pac 1000：在进行电泳时，最大电压不超过1000V，最大功率不超过80W，最大室温不超过50℃。 Amersham pharmcia Biotech公司Ettan DALT II System： (1) 此系统的电源控制为Power Supply/Control Unit：最大输出功率是200W；温度控制范围是10-50℃最大电压600V；最大电流1A。(2) 使用Gel caster灌胶模具：最多可同时灌25.5×20.5cm、1mm厚的梯度胶或均一胶14块。 Amersham pharmcia Biotech公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit： 　　胶大小为10.0×8cm ;最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需1.7L电极缓冲液，跑两块胶时需1.2L电极缓冲液；最大电压是600V，最大功率是25W；所配置电源为Electrophoresis Power Supply EPS 301。 第二向：

  14. 图像分析软件： • Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version:5.0 • BIO-RAD公司： PDQuesTM

  15. 4. 双向电泳分析中的样品制备 • 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。

  16. 特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量, 但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。 强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3-12、4-12或10-12) 进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12) 的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12) 等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。

  17. 5. 双向凝胶电泳技术流程 IPG重泡涨及样品加样 第一向等电聚焦 第二向SDS-PAGE 检测 问题及解决办法

  18. 重泡涨时间至少要10h，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。重泡涨时间至少要10h，泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。 重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关说明书。 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异。 温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在20℃，太低尿素会结晶出来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。 重泡涨时加上30-50V的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备型电泳时才有意义。 商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG Buffer, 痕量Bromophenol Blue，和裂解液成分基本相同，在10-100mmol/L浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度。 重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加到重泡涨液中，在加样杯上样 (cup loading) 方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。 IPG胶条的重泡胀

  19. 重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分。在阴极加上20mmol/L DTT润湿的纸片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。 从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。 最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。 等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。一般原则是：根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定的范围内调整。 聚焦时间的优化

  20. IEF的基本条件 voltage Time Volt-Hours Ramp Stemp 1 250 20min －－－ Linear Stemp 2 4000 7 cm 2hr Linear －－－ Stemp 3 4000 －－－ 10,000V-hr Rapid total 5 hr 14,000V-hr Stemp 1 250 20min －－－ Linear 11 cm Stemp 2 8000 2.5hr －－－ Linear Stemp 3 8000 －－－ 20,000V-hr Rapid 5.3 hr total ～30,000V-hr Stemp 1 250 20min －－－ Linear 17 cm Stemp 2 10000 2.5hr －－－ Linear Stemp 3 10000 －－－ 40,000V-hr Rapid total 7 hr ～50,000V-hr

  21. 两维间的平衡 • 一维（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。 • 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE 时电泳能顺利进行。 • 建议方案是：用含2% (m/v) SDS、1% (m/v) DTT、6 mM尿素和30%甘油的50mM Tris (pH8.8) 缓冲液先平衡15min，再用5% (m/v) 碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15 min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。

  22. 二维 SDS-PAGE • 同普通SDS-PAGE类似。 • 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把 IPG 胶条看作是压缩胶，因为在 IPG 胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性 IEF 胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。 • IPG 胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以清洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板推到SDS-PAGE胶上端。 • IPG胶条转移到SDS-PAGE有两种方式：一种方式是先将IPG胶条放到SDS-PAGE胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先加入熔化的琼脂糖溶液，再将 IPG 胶条放到SDS-PAGE胶 上。两种方法各有优劣，第一种方式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好地解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入IPG胶时有时会造成图谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常推荐第一种方式。 • SDS-PAGE胶的浓度需根据研究目的和样品性质而定。常用的是12%和12.5 %的均一胶，灌胶方便，重复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较为聚集，分离不佳。如采用9-16%的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白质点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。 • 电泳过程中温度一般控制在10-15℃。

  23. 聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测 理想显色剂的7S • 安全 (safety)； • 灵敏 (sensitivity)； • 简单 (simplicity)； • 特异性 (specificity)； • 快速 (speed)； • 稳定 (stability)； • 兼容性 (synergy)。

  24. 有机染料和银染 • 考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 • 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。 • 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。 • 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 • 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。

  25. 负 染 • 能专门提高 PAGE 胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 • 结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。 • 速度快 (5~15min)，蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如 EDTA 或 Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。 • 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。 • 该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。

  26. 胶体扩散染料 • 主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。 • 最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。 • 这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。

  27. 有机荧光团染料 • 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。 • 这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。 • 这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。 • 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。

  28. 金属螯合染料 • 这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台 (包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等) 相结合。 • 其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。

  29. 凝胶的图像处理和分析 典型流程： • 凝胶图像的扫描； • 图像加工； • 斑点检测和定量； • 凝胶配比； • 数据分析； • 数据呈递和解释； • 2-DE数据库的建立。

  30. 2D-PAGE问题与原因第一向等电聚焦的问题

  31. 2D-PAGE问题与原因第二向 SDS-PAGE（垂直系统）的问题

  32. 2D-PAGE问题与原因 —— 染色的问题

  33. Thanks !

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