Seminário Biologia Molecular & Métodos Analíticos

1. Seminário Biologia Molecular & Métodos Analíticos Por: Anderson Moura; Amélia Somensi; Argus Rocha Neto; Clarissa Feltrin e Luan Aires.

2. OBJETIVO: Proporcionar a compreensão das atividades enzimáticas fundamentais utilizadas na clonagem molecular.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA: Dogma Central da Biologia Molecular: Transcrição Tradução DNA RNA PROTEÍNA Replicação As sínteses de DNA, RNA e Proteica envolvem três etapas básicas: Iniciação da cadeia. Ampliação ou alongamento da cadeia. Término da cadeia.

4. Antes de ocorrer a condensação dos cromossomos é necessário haver a duplicação do DNA.

5. Replicação Semiconservativa: • Watson e Crick (1953): duplicação do material genético por complementariedade. • Matthew Meselson e Franklin Stahl (1958): • - Cultivo de bactérias em isótopo 15N.

6. Experimentos de Meselson e Stahl (1958): Células transferidas para meio com 14 N Extração e Purificação de DNA Cultivo bacteriano em meio contendo o isótopo 15N

7. Como ocorre a replicação: Em 1963 John Cairns por meio de auto-radiografia de bactérias, percebeu a existência de um ponto inicial para a replicação, denominado Origem da replicação. Acreditava que a replicação era unidirecional. Isolamento do DNA, espalhamento em emulsão fotográfica Observação em microscópio eletrônico Cultivo de E. coli em meio contendo timidina (3H)

8. Na origem se formam duas forquilhas de replicação: Estrutura da oriC, o único ponto de replicação em cromossomos circulares bacterianos.

9. Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas. DNA Parental DNA Replicado Forquilha de Replicação

10. Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação. • Célula procarióricapossui um único replicon. • Células eucarióticaspossuem vários repliconse todos são ativados uma única vez no ciclo celular, ainda que não simultaneamente.

11. Primeiro passo: • Abrir o DNA (forquilha de replicação) e manter as fitas complementares separadas, para que a DNA polimerase inicie atividade: • Topoisomerase. • Helicase. • Proteína ligante de DNA (SSB).

12. As DNAs polimerases são as enzimas que sintetizam DNA: Também possuem função em atividades auxiliares e de reparo. As duas fitas parentais são separadas e cada uma atua como molde para síntese de uma nova fita.

13. Síntese de DNA envolve a formação das ligações fosfodiéster:

14. Principais DNA polimerases e suas funções:

15. A síntese de DNA é semidescontínua: As fitas filhas alongam-se com o desenrolamento da forquilha? • Lembrem-se: • Sentido da síntese sempre é 5’ 3’. • A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3’ – OH da cadeia em crescimento.

16. A síntese de DNA é semidescontínua: Então, qual é o mecanismo? Fragmentos de Okazaki

17. A síntese de DNA é semidescontínua: Fitadescontínua (Filamento lagging) Fitacontínua (Filamento leading)

18. A síntese de DNA é semidescontínua: Por que todas as enzimas DNA polimerases promovem o crescimento da fita de DNA somente na direção 5’ para 3’?

19. Conversão do DNA duplex em fita simples: Para que a replicação ocorra, três atividades são necessárias para converter a dupla fita de DNA em um estado de fita simples: Helicase: Topoisomerase: Proteína ligante DNA (SSB): Classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA, utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula. Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada. Ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.

20. Um iniciador é necessário para o começo da síntese de DNA: • Primase: • Cataliza a síntese de um pequeno RNA (primer). • Fornece o iniciador para DNA pol III.

21. Um iniciador é necessário para o começo da síntese de DNA: Em relação a síntese da fita descontínua, vários iniciadores de RNA são produzidos pela primase para possibilitar a ligação dos fragmentos de Okazaki.

22. Os fragmentos (Okazaki) sintetizados na fita descontínua são ligados enzimaticamente (LIGASE) para gerar uma fita contínua.

23. Braçadeira β: conecta a DNA polimerase ao DNA: • Circunda o DNA; • Associa-se com DNA pol III deixando-a altamente processiva; • Mantém DNA pol III ligada à molécula de DNA.

24. Replicação: velocidade e precisão Manutenção deVELOCIDADEe PRECISÃO REPLISSOMO ATIVIDADE REVISORA SISTEMAS DE REPARO ~ 1 erro/ 109 nucleotídeos Velocidade: 1000 nucleotídeos/segundo cada E. coli (20 a 40 min.)

25. Replissomo:

26. Atividade revisora (atividade exonuclease 3’ 5’) garante a fidelidade da replicação:

27. Visão geral da replicação: • HELICASE. • TOPOISOMERASE. • BRAÇADEIRAS. • PRIMASE. • DNA POLIMERASE III. • DNA POLIMERASE II. • DNA POLIMERASE I. • DNA LIGASE.

28. DNA Polimerases Enzimas responsáveis pela polimerização de uma nova molécula de DNA através da adição de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPs).

29. DNA Polimerases procariotos

30. Fragmento Klenow E. Coli Polimerase 5’ 3’ Exonuclease 3’ 5’

31. DNA Polimerase T4 Atividade de exonuclease 3’ 5’ e de polimerase 5’  3’; Não apresenta atividade de exonuclease 5’ 3’; Pode ser utilizada na finalização da extremidade 5’ saliente e marcação do terminal 3’ da fita dupla de DNA; Atividade de exonuclease: retira aproximadamente 40 bases/minuto na fita dupla e 4000 bases da fita simples; Atividade de endonuclease: polimeriza 15000 nucleotídeos/minutos em condições padronizadas.

32. DNA Polimerase do bacteriófago modificado T7 • Complexo de duas ptns: • Produto de 84 kDa do gene 5 do T7 – propriedade catalítica; • Tireodoxina da E. Coli de 12 kDa – conecta o gene 5 ao molde do iniciador. • Polimerização de milhares de nucleotídeos sem dissoaciação; • Taxa de polimerização de mais de 300 nucleotídeos/segundo; • Utilizado no preparo de sondas radioativas e amplificação de grandes fragmentos de DNA; • Identificado uma região de 28 aa com atividade de exonuclease 3’  5’; • A deleção desta região aumenta a taxa de polimerização e de mutação espontânea; • Alta eficiência em incorporar nucleotídeos análogos (5’(α-thio)-dNTPs, dc7-GTP ou dITP) usados para melhorar a resolução do sequenciamento de DNA no gel.

33. DNA Polimerase do bacteriófago modificado T7

34. Terminal deoxinucleotidil transferase (TdT) • Cataliza a adição de homopolímeros nas terminações das caudas de DNA de uma maneira independente do molde; • Utilizada para marcação com nucleotídeos modificados; • Ensaios de apoptose; • Tdt requer a presença de um iniciador de DNA fita simples na presença de Mg+2; • Aceita a presença de um iniciador de DNA fita dupla na presença de Co+2.

35. DNA Polimerases termoestáveis • Purificadas no início dos anos 70; • Interesse com o desenvolvimento da técnica de PCR.

37. TAQ Polimerase Yellowstone National Park Purificada em 1976 da bactéria Thermophilus aquaticus - 70°C e 80°C; Considerada a molécula do ano pela revista Science em 1989; Meia vida de 40 min a 95°C e 30 min a 100°C; Atividade ótima: 80°C e Mg+2;

38. TAQ Polimerase Não possui atividade de revisão; Adição de resíduos de adenina nas terminações 3’nos produtos de PCR; Outras DNA polimerases foram descobertas – mais eficientes; As polimerases de DNA termoestáveis são comumente chamadas de Taq.

39. BST Polimerase DNA Pol I isolada em 1968 da bactéria termofílica Bacillus stearothermophilus (Bst) (39-70°C); Ativa a 65°C e inativa depois de 15 min à 75°C; Atividade exonuclease 5’3’- requer Mg+2; Proteases geram dois fragmentos; O maior fragmento é mais veloz do que a enzima íntegra.

40. THT Polimerase Isolada do Thermus thermophilus HB-8; Não possui atividade de revisão; Na presença de Mg+2 induz polimerização de DNA e na presença de Mn+2 tem atividade de transcriptase reversa.

41. DNA Pol termoestáveis c/ atividade de revisão

42. Hot start Objetiva evitar eventos não-epecíficos como: hibridização ou formação de dímeros no iniciador; Introduz uma barreira entre as estruturas secundárias e o sítio de ligação da DNA polimerase durante o seu preparo; A barreira pode ser: anticorpo, oligonucleotídeo ou modificação química reversível; Liberada das enzimas durante o primeiro ciclo de desnaturação do PCR – restaurando a atividade enzimática apenas depois da desnaturação das estruturas secudárias.

43. Hot start

44. Transcriptase reversa ou DNA polimerase dependente de RNA

45. Vírus Epstein-Barr - 1964 Papilomavírus Humano (HPV) – 1983 Agente filtrável em sarcoma Rous Sarcoma Virus (RSV) Peyton Rous, 1911 1970 – Transcrição reversa (Temin e Mizutani, 1970) 1960 – 1961 Genoma RNA DNAc

46. Ocorrência natural da TR Retrovírus • Rous Sarcoma Virus (RSV) • Raucher Leukaemia Virus (RLV)

47. TRs virais

48. TRs não virais Elementos transponíveis • TRANSPOSONS • - 80% genoma total das plantas • 45% genoma humano • Cortar e colar • RETROTRANSPOSONS • - 42% do genoma humano • Copiar e colar

49. TRs não virais Telômeros – Sequências não codificadoras DNA Polimerase? Telomerase – Enzima composta por RNA e TR que introduz nucleotídeos na região 3’ possibilitando a reconstrução dos telômeros.

50. TR e biologia molecular • RT- PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) Preparação de bibliotecas DNAc e sequenciamento.