Pseudomonas aeruginosa diversity in distinct paediatric patient groups

1. Pseudomonas aeruginosa diversity in distinct paediatric patient groups Tramper-Stranders G. A.,C.K van der Ent ,T. F. W. Wolfs,J.L.L. Kimpen,A. Fleer, U. Johansen,H.K. Johansen and N.Hoiby DENMARK Clin Microbiol Infect 2008;14:935-941

2. FARKLI PEDİYATRİK HASTA GRUPLARINDA PSEUDOMONAS AERUGİNOSA ÇEŞİTLİLİĞİ Prof.Dr. E.İnci Tuncer Arş.Gör.Dr.Oya Akkaya

3. GENEL BİLGİLERBakterilerde genotip ve fenotip • Bir mikroorganizmanın özellikleri kalıtımın temel yapıtaşı olan genlerle nesilden nesile geçer • Genler, kromozom ya da kromozom dışı genetik elementler boyunca sıralanırlar ve canlının tüm özelliklerini belirler • Bir canlının sahip olduğu genlerin tamamı veya DNA’sının baz sıralaması, o canlının genotipini (genetik yapısını) oluşturur • Bakteri DNA’sı tek bir molekülden yapılmıştır ve bakterinin kromozomu olarak ta adlandırılır

4. Genlerin tamamı her zaman çalışır durumda değildir • Örneğin belli besin maddelerinin kullanımı için gerekli enzimlerin sentezini kontrol eden genlerin birçoğu • Sadece o maddenin varlığında çalışır • Genlerdeki genetik bilginin ifade edilmesi sonucu • Canlının gözle görülebilen spesifik özellikleri yani fenotipi oluşur

5. Fenotipik değişim • Diğer canlılarda olduğu gibi mikroorganizmalarda da fenotip, genotip ile çevre koşullarının karşılıklı ilişkileri sonucu oluşur • Mikroorganizmalarda gözlenen değişmelerin büyük bir kısmı farklı çevre koşullarının etkisi ile farklı fenotiplerin ortaya çıkmasından kaynaklanır • Hangi genin ifade edileceğinin ve ayrıca nasıl ifade edileceğinin belirlenmesinde ısı, pH, kültürün yaşı ve nem gibi bakterilerin yaşadığı ortam koşullarının etkisi vardır

6. Kistik fibrozis • Otozomal resesif geçiş gösteren ve Avrupa ülkelerinde yaklaşık 3200 canlı doğumda bir görülen bir hastalıktır • Kistik fibrozis (KF) geni 7. kromozomun uzun kolunda yerleşmiş bir gendir • Klor kanalında, epitelyal hücrelerde sodyum ve su transportunda rol oynar • Bu nedenle hem bu gen hem de ürünü olan protein CFTR (cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator) olarak adlandırılır • Değişik basamaklarda mutasyonlar gösterebilir

7. Kistik fibrozis 2 • Kistik fibrozis, epitelyal yüzeyi olan pek çok organ ve sistemi tutar • En sık olarak akciğer, pankreas, intestinal mukozal glandlar, karaciğer, reprodüktif sistem ve ter bezlerini etkiler • KF’ de bu organ ve sistemlerde epitelyal yüzeyde anormal iyon transportu olur • Epitelyal hücrelerde geçirgen olmayan klor kanalı ve sodyum pompası bu organ lumenlerinde biyokimyasal ve biyoelektriksel anormalliklere yol açmakta ve intraluminal sekresyonlarda yoğunlaşma olmaktadır • Bu anormal yoğun sekresyon ise kanallarda tıkanmaya yol açmaktadır.

8. Kistik fibrozis 3 • Kistik fibrozisli hastalarda CFTR yokluğuna veya fonksiyonel yetersizliğine bağlı olarak • klor reabsorbsiyonu normalden daha az gerçekleşir ve bu da terdeki sodyum ve klor miktarının genelde 60 mEq/L den çok olmasına neden olur • Bu nedenle bu hastalar çok kolay dehidratasyona girebilirler ve sıcağa karşı tahammülsüzlük gösterirler

9. Kistik fibrozis 4 • P.aeruginosa, KF hastalarının solunum yollarında en sık saptanan patojendir • Ama ne şekilde kazanıldığı tam olarak açıklanamamıştır • KF hastalarında infeksiyona yol açan suş infeksiyon sürecince doğal fenotipten KF fenotipine dönüşmektedir(nonmukoid ve hareketliden, mukoid ve hareketsize) • İnfeksiyon süresince belli bir suşu taşıyan hastaların varlığı, infeksiyonun çevresel bir kaynaktan kazanıldığını düşündürmektedir

10. Kistik fibrozis 5 • Tedavi • İnfeksiyonun alevlenmesi sırasında ve kolonizasyonun eradikasyonu için yapılır • Devamlı nebulize antibiyotikler etkilidir • Kronik P.aeruginosa kolonizasyonundan korunması gerekmektedir

11. GİRİŞ • Pseudomonas aeruginosa,kistik fibrozis (KF)’li hastalardaki kronik pulmoner infeksiyonların en sık sebebidir • KF’ li hastalarda P.aeruginosa infeksiyonlarına yatkınlık vardır • KF’deki mutant CFTR (Cystic Fibrosis Transmembran Regülatör) proteinler nedeniyle hücreler P.aeruginosa’ya bağlanamaz ve öldüremez • Pulmoner akışkan tabakanın volümü düşer ve elektrolit oranı değişir • Bu da mukusun viskozitesinin artmasına ve saydamlığının bozulmasına neden olur

12. Mukus tabakasında ise aljinat üretimi bozulur ve mutasyonlarla nonmukoid tipten mukoid fenotipe dönüşüm olur • P.aeruginosa immunkomprimize veya savunma defekti olan hastalarda infeksiyon yapar • Önce epitele yapışıp sekresyon üretir • Sonra bu sekresyon, hücrelerin sinyal iletimini engeller • Konakta doku yıkımı ve immün cevap gelişir • Buna karşı P.aeruginosa elastaz, fosfolipaz C ve ekzotoksin A üretir • KF’ li hastalarda akut infeksiyon yüksektir

13. KF’li hastalardaki kronik P.aeruginosa infeksiyonundan belli bir bakteriyel bir genotip sorumludur • Bu genotip hastalar arasında yayılmadan da sorumludur • Bu genotipe epidemik suş veya klon denir • KF ’li hastalar P.aeruginosa infeksiyonuna çok duyarlıdır

14. KF dışında bazı hasta grupları da P.aeruginosa infeksiyonuna duyarlıdır. Bu hastalıklar: • CSOM (Kronik süpüratif otitis media) ’li çocuklarda daha önce geçirdikleri akut ataklar sonucunda iç kulak epitelinde hasar oluşur • P.aeruginosa hasarlı epitele yapışır ve biyofilm oluşturur • Üriner sistemde de üretral kateterle epitel hasarı oluşur ve P.aeruginosa hasarlı epitele yapışır • YBÜ’nde yatan hastalarda da pnömoni ve sepsise neden olur • Yoğunbakım pnömonisinin sebebi, ventilatörün respiratuvar epitelede hasara yol açması ve daha sonra oral ve gastrik materyalin mikro-aspirasyonudur

15. Primer ve sekonder immunyetmezlikli olanlarda da P.aeruginosa infeksiyonlarına eğilim yüksektir • Burada P.aeruginosa’ya karşı immun cevap sadece nötrofillerin toplanmasıyla değil T-lenfositlerle de sağlanır • KF ’li olmayan hastalarda P.aeruginosa infeksiyonlarına eğilim tam açıklanamamıştır • Yapılan bazı çalışmalarda YBÜ’nde ve üroloji servislerinde MDR-P.aeruginosa birçok salgında tanımlanmıştır

16. Bu çalışmada ise; • 5 farklı pediyatrik hasta grubunda • P.aeruginosa infeksiyonlarına duyarlılık ve • P.aeruginosa’nın klon oluşturması araştırılmıştır

17. Materyal ve metodlar 5 pediyatrik hasta grubu bu çalışmada kullanılmıştır. • 1. grup : 29 tane KF’ li hasta grubu olup ilk defa balgam kültüründe P.aeruginosa pozitif olan hastalardan oluşmuştur • 2. grup: 27 tane KF ’li hasta grubu olup kronik P.aeruginosa infeksiyonu olan ve %50 ’sinden çoğunda balgam kültüründe P.aeruginosa pozitif olan hastalardan oluşmuştur • 3. grup: 34 tane tekrarlayan üriner sistem infeksiyonu olan veya anatomik defekti olan hastadan oluşmuştur • 4. grup: 43 tane (CSOM) Kronik süpüratif otitis media’lı hastadan oluşmuştur • 5. grup: 24 tane immün defekti olan ve YBÜ’ nde yatan kazanılmış P.aeruginosa infeksiyonu olan hastadan oluşmuştur

18. Kültür ve duyarlılık testleri • Hastalardan swablarla alınan örnekler kültür için kanlı ve EMB agara ekildi ve 24-48 saat inkübe edildi • P.aeruginosa hem konvansiyonel yöntemlerle yani koloni morfolojisiyle ve pozitif oksidaz reaksiyonu ile hem de Phoenix BD otomatize sistemiyle identifiye edildi • Aynı zamanda otomatize sistemle ve disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılık testleri yapıldı • Otomatize sistemin tanımlayamadığı örnekler API 20 NE ile tanımlandı ve MIC değerleri E-testle belirlendi • Sonuçlar CLSI kriterlerine göre yorumlandı • Fenotipik olarak farklı olan örneklerden birer koloni -80 °C’de saklamaya alındı

19. PFGE • İzolatlar arasında % 80 homoloji olduğu görüldü

20. Anti-psödomonal antibiyotiklere invitro direnç • Duyarlılık testleri, kullanılan antibiyotiklere %15 direnç olduğunu ortaya koymuştur • 25 örnek sadece 1 antipsödomonal antibiyotiğe dirençli, 5 örnek ise birden çok ilaca dirençlidir. • Tüm anti-psödomonal antibiyotiklere dirençli bir örnek yoktur • En yüksek direnç oranı UTI grupta, sonra sırasıyla CSOM ve KF kronik grubundadır • Bu direnç oranları KF-1 ve YBU hastalarında da aynıdır • Farklı hasta kategorilerinde belirgin bir direnç paterni gösterilememiştir

22. Kistik Fibrozisli hastalarda kronik P.aeruginosa infeksiyonu • 14 tane KF klon taşıyıcısı, 13 tane klon taşımayan ve başka genotipe sahip olan hastadan daha yaşlıydı • Bu 13 tane farklı genotipli klonun 2 tanesinin klonla ilişkili olabileceği görüldü • Klonal örnek taşıyıcılarının infeksiyonlarının, diğerlerinin infeksiyonundan uzun sürdüğü gürüldü • Aynı klondan olan bakterilerin birkaç fenotipik görünüm sergileyebileceği gösterildi • Mukoid ve nonmukoid örneklerin aynı hastaya ait olabileceği görüldü ve • Klonal genotip taşıyanlardaki direnç oranları diğer genotip taşıyanlardan daha yüksekti

23. Tartışma • P.aeruginosa infeksiyonunun olduğu 5 farklı hasta grubunda • Farklı fenotipler ve direnç paternleri gözlenmiştir • P.aeruginosa örneklerinin çoğu aynı genotiplidir • KF’li hastalar arasında yaygın olan klonal örnekler, diğer hasta gruplarında rastlanmamıştır • Bu çalışmada P.aeruginosa eğilimi olan hasta grupları araştırılmıştır • Çünkü KF’li hastalar için klonalite önemlidir

24. KF, epitel hücrelerindeki CFTR proteinlerinin kaybıyla ilgili intrensek bir bozukluktur • Hastalarda P.aeruginosa infeksiyonu olması için epitelyal hasar gereklidir • P.aeruginosa hasarlı akciğer, iç kulak veya üriner sistem epiteline oturur • Elektrolit bozukluğu, inflamasyon ve hipervisköz mukus gibi bozukluklar da infeksiyona zemin hazırlayan diğer sebeplerdir

25. KF’li hastalarda nonmukoid formdaki P.aeruginosa’nın ilk kolonizasyonu erken dönemde eradike edilebilir • Ama arkasından aynı veya farklı genotipte P.aeruginosa ile yeniden kolonizasyon oluşur • Bu kolonizasyon antibiyotiklerin penetrasyonuna engel olduğu için • artık eradikasyon pek mümkün olmaz ve bu kolonizasyon kronik infeksiyonla sonuçlanır

26. Klonal P.aeruginosa ile kolonize olan KF’li hastalarda tipik akciğer infeksiyonu ortaya çıkar • KF-1 grupta 29 hastadan sadece 2’sinde klonal genotiple infeksiyon görülmüştür • Diğer gruptaki P.aeruginosa infeksiyonları antibiyotik tedavisiyle eradike edilebilir ama • Yeniden bulaş olursa predispozisyon nedeniyle yeniden infeksiyon olabilir • Eradikasyon başarısız olursa bakteri konağa adapte olur ve kalış süresi uzar

27. Hastalar arasındaki temas P.aeruginosa’nın geçişini ve yayılımını kolaylaştırır • Bu durum birlikte yaz kampına alınan KF’li hastalar arasında gösterilmiştir

28. Bu çalışma için hasta grubu 2005 yılında KF’li hastaların belirlenmesiyle oluşturulmaya başlanmış • Klonal örnekli infeksiyonların çoğu bu tarihten önce oluşmuş • İnfeksiyonlar öksürükle yayılmış • KF’li hastalarda hava yoluyla, solunum sekresyonlarıyla veya kontamine malzemeyle geçiş riskinin • Diğer hasta gruplarından daha sık olduğu görülmüş • Bu çalışmada KF’li hastalar diğer hastalardan ayrılmamış ve • Diğer hastalarla KF’li hastalar arasında bulaş için ortam oluşmuş

29. Klonal örnekler KF’li hastalarda kolonize olmaya daha fazla yatkındır • Klonal örnekler arasında antimikrobiyal direnç gelişimi ve farklı direnç paternleri gözlenmiştir • KF’li gruplar içinde antimikrobiyal direnç diğer gruplarla hemen hemen aynıdır • Mukoidite ise küçük bir KF’li hasta grubunda gözlenmiştir

30. Aynı klondan olan P.aeruginosa örnekleri • Ülkeler arasında ve KF merkezlerinde bile farklılıklar gösterir • Bu yüzden farklı fenotipte görünenler aynı klondan olabilir • Klonal P.aeruginosa’nın bazen virulansı düşebilir • Bu durum konağın immun cevabına karşı korunmak için bir stratejidir • Klonal olmayan örneklerin KF’li olmayan grupta hastalık oluşturduğu gözlenmiş • KF’li hastalarda P.aeruginosa’nın kolonize olmasında genetik yapısı ve virulans faktörleri önemlidir

31. P.aeruginosa farklılıkları PFGE yöntemiyle gösterildi • PFGE, multilokus sekans tiplemesinden daha ayırtedicidir • Hem eski hem de yeni tekniklerin kullanılması • Gelecekteki çalışmalara ve klon epidemiyolojisini daha iyi anlamaya ışık tutacaktır

32. Çalışmadaki P.aeruginosa’ların sadece %2.5’i MDR’dir • Genellikle antimikrobiyal ajanlara direnç düşüktür • En yüksek ilaç direnç oranları üroloji hasta grubunda rastlanmıştır • Siprofloksasin’e direnç %10’dur • CSOM, UTI ve KF kronik grupta ilaç direnci, daha önceki antibiyotik kullanımıyla açıklanmıştır • Bulunan antibiyotik direnç verileri Avrupa örneklerinde daha düşüktür • Bu düşüklüğün sebebi de sıkı antibiyotik reçeteleme politikasıyla açıklanmıştır

33. KF’li kronik grupta klonal örnekler arasında antibiyotik direnci • Diğer örneklerden daha yüksektir • Ayrıca klonal örnek taşıyan hastalar daha yaşlıdır ve • Bu ilaç direncinin vücutta antibiyotik birikmesiyle orantılı olabileceği ileri sürülmüştür • Ama klonal P.aeruginosa örneklerinin • Önceki antibiyotik tedavisiyle ilgili olmayan bir ilaç direnç mekanizması da vardır

34. Sonuç olarak • P.aeruginosa infeksiyonuna duyarlı 5 farklı pediyatrik hasta grubunda (toplam 202 hasta) • Fenotip ve genotipte geniş bir farklılık tespit edildi • KF kronik grup örnekleri arasında benzerlik çoktu • Klonal P.aeruginosa sadece KF’li hastalarda görüldü • Diğer hasta gruplarına bulaşı görülmedi • KF’li hastaların henüz yeterince açıklanamayan bir yatkınlıkla • Klonal P.aeruginosa ile kolonize olduğu açıklandı