Virusi

1. Virusi

2. Otkriće virusa • 1892. Ivanovski, filtrabilni uzročnik mozaične bolesti duvana • 1898. Bejerink, potvrdio eksperimente Ivanovskog • 1898. Lefler i Froš, filtrabilni uzročnik slinavke i šapa • 1909. Landštajner i Poper, filtrabilni uzročnik dečije paralize • Nazvani virusi – živi otrov • 1915. Tvort i 1917. Derel, otkriće bakteriofaga – virusa koji napadaju bakterije

3. Opšte osobine • Najmanji i najjednostavniji mikroorganizmi • Nemaju ćelijsku građu – acelularni • Virusna čestica – virion • Ubrajaju se u žive organizme jer poseduju genetičku informaciju za sopstvenu reprodukciju • Na granici veličine makromolekula (20-300 nm)

4. Opšte osobine • Van ćelije metabolički inertni • Obligatni intracelularni paraziti - u ćeliji koriste metabolički aparat (enzime, ribozome) i energiju domaćina za sopstvenu reprodukciju • 1 čestica virusa može dati preko hiljadu novih virusnihčestica

5. Građa viriona • Nukleinska kiselina (DNK ili RNK) • Kapsid, proteinske prirode, izgrađen iz strukturnih jedinica – kapsomera • Nukleinska kiselina i kapsid grade nukleokapsid • Kod nekih virusa postoji dodatni omotač poreklom od citoplazmatične membrane domaćina i specifičnih virusnih proteina • U nukleokapsid mogu biti upakovani enzimi neophodni za inicijalne faze infekcije; sintetišu se i pakuju u ćeliji prethodnom domaćinu

6. DNK ili RNK jednolančana ili dvolančana, cirkularna ili linearna, neki RNK genomisusegmentirani Nukleinske kiseline virusa Proteinski omotač – kapsid • Izgrađen od kapsomera • Kubna, spiralna ili kompleksna simetrija • Kompleksna tipična za bakteriofage • Spiralna tipična za biljne viruse • Animalni virusi imaju najveću varijabilnost u simetriji kapsida

7. Kubna simetrija Ikosaedarna simetrija papova virus (dsDNK) polio virus (+ssRNK) Adenovirus (dsDNK)

8. Spiralna simetrija - TMV virus

9. Kompleksna simetrija Bakteriofag λ Bakteriofag T4 Bakteriofag Mu

10. Virusi sa omotačem • Najčešće animalni virusi, kubne ili spiralne simetrije • Na površini se uočavaju šiljci, virusni glikoproteini Kod influenca virusa: • hemaglutinin (H), vezuje se za ćelijske receptore • neuraminidaza (N), enzim koji olakšava oslobađanje iz ćelije Influenca virus

11. Virusi Archaea • DNK virusi • Virusi metanogena i halofila imaju sličnu morfologiju kao T4 fag i linearnu ds DNK • Virusi hipertermofilnih Archaea (Sulfolobus, Pyrococcus) imaju neobičnu morfoligiju i linearnu ili cirkularnu ds DNK PAV1 virus hipertermofilne Archaea roda Pyrococcus, ima kratak rep

12. Virusi Archaea DNK virusi hipertermofilnih Archaea roda Sulfolobus

13. Klasifikacija virusa • Prema domaćinu: • (bakterijski, animalni, biljni i virusi gljiva) • Prema nukleinskim kiselinama: • Prema načinu replikacije • Klasifikacija u taksonomske kategorije najviše se koristi kod animalnih virusa, najčešće do familija, sa nastavkom viridae, rodima nastavak virus, avrsta dobija naziv prema bolesti koju izaziva.

14. Replikacija virusa i klasifikacija po Baltimoru ‘+’ lanac RNK služi kao iRNK ‘-‘ lanac RNK je matrica za sintezu iRNK (komplementaran mu je) ‘+’ lanac DNK je istog smisla kao i iRNK, tj. služi kao matrica za sintezu – lanca (dvolančana replikativna forma), a onda - lanac DNK služi kao matrica za sintezu iRNK

15. Enzimi u virionu Uloga u početnim fazama infekcije • DNK polimeraza ili RNK polimeraza • Reverzna transkriptaza (retrovirusi) • Lizozim (bakteriofagi) Sintetišu se u prethodnom domaćinu i pakuju u kapsid

16. Metode studiranja virusa • Elektronska mikroskopija (moć razdvajanja 0.4-1 nm) – determinacija morfologije virusnih čestica (veličina 20-300 nm) • Imunološke metode – reakcije antigen-antitelo korisne za identifikaciju virusa u ćelijama i tkivima i za određivanje srodnosti i klasifikacijuvirusa • Izolacija nukleinskih kiselina i proteina – biohemijske metode izučavanja • Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina

17. Određivanje broja virusa

18. Životni ciklus virusa • Adsorpcija • Penetracija • Replikacija • sinteza nukleinske kiseline • sinteza proteina kapida • Sazrevanje (maturacija) • Oslobađanje iz ćelije

19. Adsorpcija i penetracija virusa • Adsorpcija na specifične receptore • Kod bakteriofaga ulazi nukleinska kiselina • Animalni i biljni virusi ulaze sa kapsidom (translokacijom, endocitozom, fuzijom membrane sa dodatnim omotačem virusa, ‘ujedom’ insekata) i nukleinska kiselina se oslobađa u ćeliji

20. Sazrevanje i oslobađanje iz ćelije • Pakovanje nukleinske kiseline u kapsid • Sklapanje kapsida “self assembly” proces, ponekad učestvuju šaperoni • Oslobađanje lizom ćelije • Prolaskom kroz citoplazmatičnu membranu bez lize • Pupljenjem (virusi sa omotačem)

21. “Kriva rasta” virusa (jednogciklusarazvića) • Posle adrsorpcije neko vreme nema zrelih virusnih čestica – period eklipse. • Period eklipse traje do pojave prvih zrelih virusa u ćeliji • Eklipsa i sazrevanje čine latentni period • Latentni period traje do oslobađanja prvih virusa iz ćelije

22. Životni ciklus bakteriofaga

23. Bakteriofagi • T2, T4 • λ (lambda) • φX174 • M13, fd • MS2 (RNK) • φ6 (segmentirani dsRNK genom i dodatni omotač, napada Pseudomonas)

24. Virulentni virusi • Sa domaćinom isključivo ulaze u litički ciklus • Rezultat razmnožavanja po pravilu je liza ćelije i oslobađanje velikog broja fagnih partikula • Na bakterijskom tepihu daju svetle plake Umereni virusi • Sa domaćinom ulaze u litički ili lizogeni ciklus • Rezultat litičkog ciklusa je liza ćelije i oslobađanje velikog br. fagnih partikula • Rezultat lizogenog ciklusa je lizogena bakterija u kojoj je virus u stanju profaga; lizogena bakterija se umnožava i svaka ćerka ćelija u sebi nosi profag (1 kopiju virusne DNK) • Profag je integrisan u hromozom domaćina (λ fag) ili je ekstrahromozomalna DNK (P1 fag) • Na bakterijskom tepihu daju mutne plake • Lizogena indukcija – prelazak u litički ciklus • Lizogena konverzija – domaćin stiče nova svojstva kodirana genima profaga (pr. Corynebacterium diphteriae)

25. T4 bakteriofag • Genom dvolančana linearna DNK sa terminalnim ponavljanjem, kodira 250 proteina, kapsid kompleksan, 25 proteina • Kompleksne simetrije: glava izduženi ikosaedar, kontraktilan repić sa dugim kukicama • Virulentni virus: sa domaćinom stupa u litički ciklus, lizira ćeliju i oslobađa se oko 100 virusnih čestica

26. Životni ciklus T4 bakteriofaga • Rani proteini (preko 20): nukleaze (isecaju DNK domaćina), DNK polimeraza, enzim za sintezu hidroksimetilcitozina, enzim za kovalentnu modifikaciju RNK polimeraze domaćina, tako da funkcioniše bez σ faktora i drugi • Srednji proteini: novi σ faktori za kasne gene • Kasni proteini: proteini kapsida i lizozim

27. Replikacija i pakovanje nukleinske kiseline • Replikacija genoma u linearnoj formi • Formiranje konkatemera rekombinacijom (džinovski molekuli DNK) • Pakovanje u glavu dok nije puna (staje više od veličine genoma) • Terminalno ponavljanje i cirkularna permutacija

28. λ fag • Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički ciklus • Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica • Genom linearna dvolančana DNK sa jednolančanim komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta = ‘cohesive sites’), u ćeliji se cirkularizuje

29. Životni ciklus λ faga • Litički ciklus: • Faza replikacije virusa • Faza maturacije virusa • Liza ćelije i oslobađanje novih viriona • Lizogeni ciklus: • Virusna DNK je profag integrisan u hromozom domaćina • Ćelija je lizogena, imuna na ponovnu infekciju istim tipom virusa • Ekspresija virusnog represora CI sprečava ekspresiju drugih gena i ulazak u litički ciklus • Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u litički ciklus

30. Regulacija ulaska u litički/lizogeni ciklus • U početku se sintetišu rani proteini uključeni i u litički i u lizogeni ciklus • Ključna uloga dva represora • Cro – represor, blokira sintezu sa promotora PL i PR kada ga ima dovoljno fag ulazi u litički ciklus • CI – represor λ faga, ključan za održavanje virusa u lizogenom ciklusu

31. Litički ciklus λ bakteriofaga Replikacija DNK virusa • θ replikacija, kasnije rollingcircle • pakovanje isecanjem cos mesta

32. Lizogeni ciklus λ bakteriofaga • Za lizogeni ciklus neophodni proteini Int (integraza, omogućava ugradnju profaga u hromozom domaćina), CII i CIII, CI. • Potrebno da se sintetiše λ represor (CI) i zaustavi transkripciju svih gena osim sopstvenog CI represor λ faga • Stabilno vezan za operatorska mesta virusnih gena • ↓ • Onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus - virus ulazi u lizogeni ciklus. • Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga, represor se odmah vezuje za operatorska mesta njegovih gena i sprečava njihovu ekspresiju, a to znači imunost na ponovnu infekciju.

33. Kada se CI represor sintetiše i veže za operatorska mesta, zaustavlja se ekspresija ranih gena • Pomoću Int proteina (mesto specifična nukleaza/integraza) genom λ se integriše u hromozom, mehanizmom rekombinacije specifične za mesto)

34. Zašto ulazak u litički/lizogeni ciklus zavisi odenergetskog stanja u ćeliji? • Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora CI i ulazak u lizogeni ciklus. • Njegova stabilnost zavisi od količine ćelijskih proteza koje ga razgrađuju odmah po sintezi. Energetsko stanje u ćeliji dobro, intenzivan metabolizam ↓ Ima dovoljno proteaza, nema CII, nema ni CI represora ↓ Litički ciklus Energetsko stanje u ćeliji loše, metabolizam usporen ↓ Nema dovoljno proteaza, CII je stabilan, CI represor se sintetiše ↓ Lizogeni ciklus

35. Lizogena indukcija • Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak u litički ciklus, omogućeno razgradnjom λrepresora. • Za izvlačenje profaga neophodan je produkt xis gena – ekscizionaza) • Spontan proces se retko dešava, ali je moguće indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ zračenje, hemijski mutageni). • U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije SOS odgovora. Jedna od manifestacija je i razgranja represora koji drže zaključane SOS gene, ali i CI represora λ faga. • Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus.

36. φX174 bakteriofag • Cirkularna + ss-DNK, ~ 5400 nt • Geni koji se preklapaju (‘overlapping genes’), fenomen početka translacije sa različitih mesta i iz različitih okvira čitanja istog nukleotidnog zapisa • kodirano 11 proteina, • Ikosaedarni kapsid, 60 kapsomera (25 nm veličine)

37. Životni ciklus φX174 bakteriofaga • Replikacija zavisna od enzima domaćina • Replikativna ds forma, teta replikacija • Transkripcija minus lanca daje policistronske iRNK • Formiranje genoma - replikacija po tipu kotrljajućeg obruča • Pakovanje i oslobađanje lizom ćelije

38. ReplikacijaφX174 bakteriofaga

39. Filamentozni M13 bakteriofag • Cirkularna + ss-DNK • Filamentozni fagi • Adsorbuju se na seks pilus (F+ ćelije E. coli su domaćini) • Pakovanje u kapsid pri izlasku iz ćelije (pupljenjem, ne ubija ćeliju domaćina) • Nema lize ćelija – nema plaka, već prosvetljenja na tepihu bakterija

40. M13 fag – korišćen u genetičkom inžinjerstvu: Pogonosti: • ssDNK virus → lako sekvenciranje • Ima dsDNK oblik (replikativna forma) neophodan za kloniranje • Inficirane ćelije se održavaju u životu, virus ih ne lizira, tako da mogu biti kontinuirani izvor klonirane DNK • Intergenski prostor koji ne kodira proteine i koji se može zameniti stranom DNK je dovoljno veliki

41. RNK bakteriofagi Bakteriofag MS2 • Ikosaedarni kapsid (25 nm) • + ss RNK genom od 3569 nt • Geni koji se preklapaju kodiraju 4 proteina: RNK replikazu (deo), protein kapsida, maturacioni protein i protein za lizu ćelije domaćina • Adsorbuje se na seks pilus F+ ćelije E.coli • RNK se koristi kao iRNK • φ6 bakteriofag • Segmentirani dvolančani RNK genom • Parazitira na Pseudomonas syringae

42. Mešovita infekcija • Dva ili više virusa inficiraju jednu ćeliju • Tokom mešovite infekcije mutantnim virusima iste vrste mogućaje: • rekombinacija • komplementacija T4 fag raste na E. coli C i K12 linijama. Mutanti u lokusu rIIne rastu na E.coli K12. U mešovitojinfekciji rastu na E.coli K12. Fagi iz pojedinačne plake: ne rastu na E.coli K12 – komplementacija rastunaE.coli K12 - rekombinacija

43. Odbrana od virusne infekcije • Bakterije sintetišu enzime - restrikcione endonukleaze • Seku dvolančanu DNK virusa (stranu DNK) na specifičnim sekvencama (ssDNK i RNK virusi nisu osetljivi) • Bakterijska DNK je modifikovana i nije osetljiva na sopstvene restrikcione enzime • Bakterije poseduju specifične restrikciono-modifikacione sisteme (npr. E.coli linije K i B, E. coli C nema restrikciono-modifikacioni sistem) • Virusi se brane od restrikcionih endonukleaza metilacijom ili glikozilacijom svoje DNK, tj. istim tipom modifikacije koji postoji u DNK domaćina. • Npr. T4 fag: modifikacija citozina u 5-hidroksimetil citozin