Protein Engineering : Site-Directed Mutagenesis dan Directed Evolution

1. Protein Engineering: Site-Directed Mutagenesis dan Directed Evolution Dessy Natalia Departemen Kimia dan KPP Bioteknologi Institut Teknologi Bandung

2. Keanekaragaman Protein • Keanekaragaman hayati • Rekayasa Protein • In silico

3. Rational Protein Design • Perubahan asam amino/urutan spesifik • Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi • Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’

4. Efficient & Rational Protein Design • Interdisiplin • Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik • Struktur 3-D protein • Computer modelling • Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur • Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related

5. Siklus Protein Design • Penapisan, pemurnian dan karakterisasi protein baru. Penentuan ukuran, sifat katalisis dan stabilitas (untuk perencanaan dan evaluasi varian) • Kloning dan ekspresi protein WT • Kristalisasi dan elusidasi struktur • Computer modelling untuk menentukan struktur 3-D WT • Komputer modelling untuk menentukan residu yang akan dirubah • Site-directed mutagenesis dan evaluasi varian protein • Rekristalisasi dan penentuan struktur varian protein • Remodelling untuk perbaikan lebih lanjut

6. Konsep Dasar Struktur Protein • Framework: mengandung ikatan hidrogen struktur sekunder • Loops: menghubungkan struktur sekunder • Exterior: bagian protein yang berkontak langsung dengan solvent • Interior: bagian yang tidak berkontak langsung dengan solvent • Core: daerah yang paling lestari pada sekuens dan struktur • Variable: daerah yang mempunyai konformasi fleksibel dan sekuens bervariasi

7. Mutasi • Loop: dapat diterima, tidak mengalami perubahan utama pada struktur, tetapi dapat mempengaruhi fungsi • Exterior: Dapat berkontak dengan molekul solvent. Sifat solvasi, kecendrungan membentuk agregat protein-protein, biasanya tergantung pada residu dipermukaan. Biasanya tidak merubah 3-D secara signifikans. • Core: perubahan residu non-polar dengan yang lain tidak mempengaruhi struktur secara signifikans. Perubahan menjadi residu polar, bermuatan pada core hidrofobik dapat mereduksi stabilitas keadaan native dan merubah konformasi protein

8. Perbaikan Stabilitas Protein • Pembentukan interaksi polar dan elektrostatik pada bagian interior core: stabilisasi ikatan hidrogen internal, jembatan garam • Peningkatan interaksi hidrofobik pada interior core • Penurunan entropi konformasi unfolding melalui perubahan residu fleksibel Gly, Ser, Ala menjadi residu rigid Thr, Val, Pro • Cross-linking melalui ikatan disulfida pada permukaan protein • Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi (Cys, Met, Asn, Gln) menjadi yang tidak dapat teroksidasi Ser, Ala

9. Pembuatan Mutan • Directed • Random • Recombination

10. Directed • rational (site directed mutagenesis) G TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA

12. Hyperthermostabilization:His133Ile, Ala209Val, His156Tyr, Asn172Arg, Ala181Thr, Asn190Phe, Asn265Tyr, Gln264Ser, Asn265Tyr • Destabilization: Asp204Lys, Lys237Asp

14. Random: Error prone PCR • Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase • Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ • Penurunan konsentrasi nukleotida • Peningkatan siklus PCR • Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb) • “asexual PCR”

15. Recombination: DNA shuffling • Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994 370, 389-91 • “sexual PCR” • Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda • DNA induk dipotong dengan DNaseI • Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase

16. Recombination DNA shuffling Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation

17. Recombination Family shuffling • Extention of technique to homologous genes • Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble

18. DNA Shuffling

21. α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens • Temperatur optimum 50oC-70oC • pH optimum 6 • Likuifasi pati dan detergen • Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) • Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant • DNA shuffling: 10.000 klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. • Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)