Fixation of tissue ( 組織固定 )

Fixation of tissue(組織固定) Lee Ming-Wei

病理組織的處理 • 醫療法第65條：醫療機構對採取之組織檢體或手術切取之器官，應送請病理檢查，並將結果告知病人或其法定代理人、配偶、親屬或關係人。醫療機構對於前項之組織檢體或手術切取之器官，應就臨床及病理診斷之結果，作成分析、檢討及評估。 • 違反第65條規定處新臺幣一萬元以上五萬元以下罰鍰，並令限期改善；屆期未改善者，按次連續處罰(第102條)。 • 醫療法施行細則第48條：本法第65條所稱組織檢體，指作成細胞抹片或切片之檢體。醫療機構依本法第65條規定將手術切取之器官及前項切片檢體送請病理檢查，應由解剖病理專科醫師作成報告。醫療機構於採取組織檢體或手術切取器官前，得請病人或其法定代理人、配偶、親屬或關係人填具聯絡方式，以利告知其檢查結果

1、標本收集和查驗程序： • 對於所有送檢的標本，必須認真執行查驗程序，方能進入下一程序，其主要程序是： ①收集標本時：要仔细查對申請單上的姓名與標本上的姓名，序號是否一致；標本的件數與申請單是否相符；標本是否用固定液固定過。②標本經上述驗收後，進行编號登記，以防錯亂。編號按年份和流水號兩種方法，如果為了今後的查找較為方便，按年份編號為較好。

2、組織取材： • 在外科送檢的諸多材料中，對於每一例病例的材料，大小都不一樣，但對於較大的標本，不可能都對其進行製作切片，因此，選擇適合於病理技術製作，適合於病理診斷且有利於回顧性研究等各方面的材料，是病理活體組織檢查的關鍵，通常把這個過程稱為取材。（一）取材時必須注意以下問題：1.取出所有送檢的標本，量其大小，秤其重量，描寫其色澤，質地，形狀和肉眼所見表面情况。當標本切開後，應詳細描述其切面的顏色，硬度，病變部位等，必要時繪圖說明。

2. 對於細小標本如肺支氣管穿刺物標本、胃腸 鏡檢體標本等，應將其染上伊紅颜色後，用試鏡紙或特别脱水袋包上或裝上，以防漏出脱水盒的小孔。3.對於有傳染性的標本，請標本徹底固定後再取材。如結合瘤標本等。4.對於罕見特殊的標本，應小心保存好，在不影響診斷的情况下，盡量保存好大體標本。以利於教學標本，陳列標本的收集。 5.邊取材邊固定，組織標本較多的單位，取材經常要花上幾個小時，如果以下午2：30開始取材，至5：30完成，那麼先取的材料就可以多固定幾個小時，如此可以防止固定時間不足，同時也可防止組織發生自溶。

6. 對於骨髓穿刺的組織，可先用10%硝酸浸泡30分鐘左右，然後再與其它組織進行處理。7. 骨組織和鈣化組織，應徹底脫鈣後，方能進行製作。8. 檢體組織取材，不能太厚，以不超过2mm為宜。以防脱水不徹底，不利於製片。9. 每取完一例標本後，所有的工具如刀，剪，鐵盤，切板等，必須用水冲洗乾淨，以免污染，混淆其它病例。10. 組織取完即刻放入打印好號碼的盒内，放入固定液中固定。

石蠟包埋之步驟 • 固定（Fixation） • 脫水（Dehydration） • 澄清（Clearing） • 浸潤（Infiltration） • 包埋（Embedding） • 切片（Sectioning）

固定的作用 • 組織經過一系列的處理後，就必須進行固定，當然有的組織是先固定，再進行處理，然後再固定。固定的作用，以組織學的角度其簡單的定義是，保持細胞、組織的固有形態和結構，使之盡量保持細胞、組織的固有形態和結構，而以免疫技術的角度，固定的作用是使細胞内蛋白質凝固，盡量减少或终止外源性酶和内源性酶的反應；防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質；以保持組織的固有形態和結構；更重要的是保持組織或細胞的抗原性，不但要使抗原不導致失活，而且不使抗原發生擴散的現象，才能在免疫組織染色時，不產生過深的背景，影響對標的物的判断。

固定的目的 • 能防止細菌的腐蝕和組織的自溶。　細菌無處不存在，它們隨時都可污染腐蝕未經處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質，凡有生命的東西，都由蛋白質组成，蛋白質被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們常可碰到這樣的問題，一塊肉不經處理放了幾天後就會變質，這是為什麼呢？除了細菌參與外，其本身也是很重要的。因為組織離體後，供應此組織的血液随之消失，細胞缺氧，細胞内溶酶體膜的結構受到破壞，破壞後釋放出溶酶體酶（lysosome內含50餘種酸性水解酶（如脂酶、蛋白質水解酶、硫酸酯酶等），日常生活中常碰到的肉變質，就是細菌污染加組織自溶的结果。

2.保存細胞固有的物質，能凝固或沉澱細胞内或組織液，糖元等，使細胞或組織基本上保持與生活時的物質一樣。細胞的固有物質，即細胞核、内質網、粒腺體、高爾基氏體、溶酶體、過氧體，細胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質，如果不将其及時固定，是很容易喪失的，尤其是很容易受到溶酶體破壞，因此應特别小心。2.保存細胞固有的物質，能凝固或沉澱細胞内或組織液，糖元等，使細胞或組織基本上保持與生活時的物質一樣。細胞的固有物質，即細胞核、内質網、粒腺體、高爾基氏體、溶酶體、過氧體，細胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質，如果不将其及時固定，是很容易喪失的，尤其是很容易受到溶酶體破壞，因此應特别小心。

3. 使組織硬化，便於切塊。剛離體的組織，都是柔軟的組織，尤其是腸道的組織，如果在没有固定時就取材，效果就很差，不是取材不規整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分離，因此要取得規整標致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材

4.對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。病理標本、種類繁多，成份複雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結核、肝炎、麻瘋、性病等等。對於此類標本，應進行徹底的固定後，再行取材，如結核球，固定時間應在3-5天。4.對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。病理標本、種類繁多，成份複雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結核、肝炎、麻瘋、性病等等。對於此類標本，應進行徹底的固定後，再行取材，如結核球，固定時間應在3-5天。

5. 保存大體標本。對於有教學任務的醫院病理科，除了疾病的診斷外，還有收集有價值的大體標本，有些大體標本，是很難得到的。因此要求在平時就要留心觀察，小心處理。遇到有教學價值的罕見的典型的標本，就必須及時固定。

6.可增强染色的作用。組織經過及時的固定，最終可見到切片有鮮豔的染色，而如果有一批未經及時固定的組織，將看到最終的結果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結論，固定可以增强染色的作用

固定的注意事项 • 組織固定越新鲜越好。組織一經離體，就能及時固定，這是最好的。根據實驗，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體後30秒至1分鐘。對於其它則是要求越快越好

組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應該太大太厚，這是因所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果較厚的組織，不經處理就進行固定，那在等待固定液進入至中間時可能這些組織早就發生自溶了。因此，對於較大的組織，必須先進行處理，切成適當大小再行固定，如遇到胃腸的器官，则應將其剪開，放平後，再行固定，若非特急病例，最好在固定後才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，没固定時，難以取得最佳製片材料，對於產酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現自溶現象。

對不同類型的組織應適當合理地選擇固定液。有的固定液對於組織有膨脹作用。固定劑是一種化學試劑，有液體体和固體之分，一般使用較多的是液體，而固體固定劑如多聚甲醛，則多用於實驗研究的組織固定。對不同類型的組織應適當合理地選擇固定液。有的固定液對於組織有膨脹作用。固定劑是一種化學試劑，有液體体和固體之分，一般使用較多的是液體，而固體固定劑如多聚甲醛，則多用於實驗研究的組織固定。 • 固定劑的種類繁多，成份複雜，對組織的作用不盡相同，英國著名的組織化學家Pearse指出：對於每個既定的組織化學方法來說，選擇最合適的方法是極為重要：在組織化學研究準備階段段不論採用什麼固定劑，都必須盡可能準確地知道它們對於各種組織成分的反應基團的效用。 • Jones（1973），指出理想的固定劑必須具備的條件是，防止渗透損傷和緊縮，以達到在各級可見度的水平皆無型態變化；要求組織所有的成分能保留於原位。他認為有三種試劑即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近於達到上述要求。

為了更好地把組織中各種成分盡量保存好，就不能千篇一律地使用一種固定液，而必須謹慎地深入研究各種固定液的性能和使用方法。例如：丙酮，它對組織有明顯的皺縮，硬化作用，平常它是決不會被用來作固定液的，用它不但太浪費，造價太高，而且也使切片較為困難，但是，對於某些酶的研究，狂犬病腦組織的固定，某些細胞的培養等。最好的固定液還是丙酮。因為如果使用福馬林固定液、石臘切片顯示酸鹼磷酸酶就顯示不好，狂犬病病毒的包函體就會消失，又如醋酸，它對膠原纖維等有膨脹的作用。由於各種固定液對不同的組織有不同的作用，因此許多專家根據各種固定液的優缺點，配製許多混合液的方法來。但是，值得指出的是並非所有的固定液都是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，對組織固定很好，組織中各物質的染色也十分清晰，但對固定脱水盒為銅質的組織時，效果就不好，原因是醋酸跟酮可發生反應，產生醋酸銅，沉澱於組織中，可造成對抗原的损害。由此可見，固定液的選擇正確與否决定著對某些病例的免疫化學標記的成敗關鍵。在我們的日常工作科研中，對於組織的固定，應有針對性的選擇，方能獲得满意的效果。為了更好地把組織中各種成分盡量保存好，就不能千篇一律地使用一種固定液，而必須謹慎地深入研究各種固定液的性能和使用方法。例如：丙酮，它對組織有明顯的皺縮，硬化作用，平常它是決不會被用來作固定液的，用它不但太浪費，造價太高，而且也使切片較為困難，但是，對於某些酶的研究，狂犬病腦組織的固定，某些細胞的培養等。最好的固定液還是丙酮。因為如果使用福馬林固定液、石臘切片顯示酸鹼磷酸酶就顯示不好，狂犬病病毒的包函體就會消失，又如醋酸，它對膠原纖維等有膨脹的作用。由於各種固定液對不同的組織有不同的作用，因此許多專家根據各種固定液的優缺點，配製許多混合液的方法來。但是，值得指出的是並非所有的固定液都是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，對組織固定很好，組織中各物質的染色也十分清晰，但對固定脱水盒為銅質的組織時，效果就不好，原因是醋酸跟酮可發生反應，產生醋酸銅，沉澱於組織中，可造成對抗原的损害。由此可見，固定液的選擇正確與否决定著對某些病例的免疫化學標記的成敗關鍵。在我們的日常工作科研中，對於組織的固定，應有針對性的選擇，方能獲得满意的效果。

組織固定，時間不宜太短，也不宜太長。時間太短，就不能很多的固定組織，因為不管組織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時間，時間太短，就會影響組織固定的效果，對以後一系列關係的處理都有影響，切片質量難以保証，固定時間太長，也不好。組織長時間的固定，福馬林會產生一種酸，影響核的染色。對于固定很長時間的陳列性標本製片後切片染色不鮮豔。另外，長時間的固定往往會出現福馬林色素(為暗褐色結晶狀，為由甲醛酸性水溶性. 作用於含血組織而形成)，尤其是造血器官的標本，更應注意。固定時間過長，可降低抗原的活性。

固定液的量要充分。固定液量的足够與否决定著組織固定的成敗，有的人認為，固定液的量與組織的比應是20：1，這個要求對於小組織來說是完全可以達到的，但對於大標本來說，則是一件非常困難的事情。因為對於大醫院來說，每天都有幾百例的標本，大的達幾十斤的腫瘤，對於這樣大的標本，按20：1的比例來做，顯然是不可能的事，既要做到組織能固定好，又不使組織吹乾就必須具體情况具體處理。對於大的標本，原則上是不讓其暴露部分被吹乾，這是因為在現實當中，大的標本往往露出容器一大半，因此對於這種情况，應取些脱脂棉或纱布，浸濕固定液後，蓋於組織表面，以免使組織被風乾，影響製片效果。固定液的量要充分。固定液量的足够與否决定著組織固定的成敗，有的人認為，固定液的量與組織的比應是20：1，這個要求對於小組織來說是完全可以達到的，但對於大標本來說，則是一件非常困難的事情。因為對於大醫院來說，每天都有幾百例的標本，大的達幾十斤的腫瘤，對於這樣大的標本，按20：1的比例來做，顯然是不可能的事，既要做到組織能固定好，又不使組織吹乾就必須具體情况具體處理。對於大的標本，原則上是不讓其暴露部分被吹乾，這是因為在現實當中，大的標本往往露出容器一大半，因此對於這種情况，應取些脱脂棉或纱布，浸濕固定液後，蓋於組織表面，以免使組織被風乾，影響製片效果。

組織的第二次固定或後固定。在一般的常規病理組織中，往往用一種固定液，就能够達到目的，獲得满意的結果。但是，對於某些特殊病例光用一種固定液是不够的，必須根據不同的情况，使用特殊的固定液再次把組織固定，或者在切片後染色前再行固定。這種方法稱為二次固定或後固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由於腫瘤細胞發育較不成熟，完全不像成熟的横紋肌組織所固有的横紋，在進行特殊染色前，就必須用Zenker氏固定液進行第二次固定，方能較好地顯示出横紋肌纖維來。否則，效果不佳。另外，電子顯微鏡固定的標本，通常都需要後固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用鋨酸固定。組織的第二次固定或後固定。在一般的常規病理組織中，往往用一種固定液，就能够達到目的，獲得满意的結果。但是，對於某些特殊病例光用一種固定液是不够的，必須根據不同的情况，使用特殊的固定液再次把組織固定，或者在切片後染色前再行固定。這種方法稱為二次固定或後固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由於腫瘤細胞發育較不成熟，完全不像成熟的横紋肌組織所固有的横紋，在進行特殊染色前，就必須用Zenker氏固定液進行第二次固定，方能較好地顯示出横紋肌纖維來。否則，效果不佳。另外，電子顯微鏡固定的標本，通常都需要後固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用鋨酸固定。

固定液的使用根據Bencroft的分類法，把不同的固定劑分為四種類型：固定液的使用根據Bencroft的分類法，把不同的固定劑分為四種類型：第Ⅰ類：醛類，甲醛（formaldehyde、HCHO ），戊二醛（Glutaraldehyde ，C5H8O2），多聚甲醛（Paraformaldehyde 、(CH2O)n ），丙烯醛（allylaldehyde 、CH2CHCHO ），已二醛（Glyoxal 、C2H2O2），丙二醛（malondialdehyde, MDA 、C3H4O2）等。第Ⅱ類：氧化劑類，四氧化锇，高锰酸钾，重铬酸钾第Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。第Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其餘的也在其它病理技術方面中用到。下面根據使用的需要，著重介绍幾種常用的固定劑。

多聚甲醛合成與分解

甲醛(formaldehyde) • 甲醛甲醛商品名為福馬林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛氣體飽和於水而成，比重為1.12。它也可以穩定的固體形式存在，它的成分為高分子量的聚合體，稱為多聚甲醛。 • 純粹的甲醛是無色具有刺激性的氣體，觸及皮膚即硬化，故毒性很強。沸點－19℃。能與空氣及氧氣混合為爆炸氣體。能燃燒。溶於水及醇，但僅微溶於丙酮、苯、醚。 • 甲醛氣體在高壓及低溫下，能液化，但氣體的甲醛和液態的甲醛，在常溫下極易聚合，因此在商業上無法供應不聚合的甲醛氣體或液體，通常都是以水溶液出售。

甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質如甲醇，這種在組織化學方法當中，能使酶鈍化，影響其反應。甲酸，它可使固定液變酸，在陳列標本或長時間固定的組織，由於酸的作用，往往細胞核染色欠佳。甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質如甲醇，這種在組織化學方法當中，能使酶鈍化，影響其反應。甲酸，它可使固定液變酸，在陳列標本或長時間固定的組織，由於酸的作用，往往細胞核染色欠佳。 • 甲醛有效固定作用的要點是，在蛋白質末端基團之間形成交聯鍵。参與甲醛固定蛋白質的基團，主要為氨基，聯氨基及肽，OH基，SH和芳香環。甲醛與組織蛋白累的反應是多樣和復雜的，因為它能和多種不同的功能基團結合，在多數情况下在其間形成架橋。甲醛有這種交聯的功能，也是它的缺點，在用甲醛固定過的組織中，需要做免疫組織染色的，往往提倡用酶消化或熱抗原修復法來使蛋白與甲醛交聯的醛鍵断裂，以利於後來的染色。 • 甲醛可配成简單的或混合的固定液，最简單和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，這就是10%的福馬林.當然,現在使用的固定液要求較為嚴格,最好是使用缓冲福馬林固定液,這有利於後来的免疫組織化學染色的需要.

Formaldehyde interacts with proteins by modifying lysine residues to generate intermolecular aldol cross-linkages

甲醛是一種良好的固定劑,它有很多的優點:1. 組織收縮較少,损傷少,保存固有物質2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使組織硬化,增進組織彈性,有利於切片.4. 能保存脂肪及脂類物質.5. 成本較低. • 雖然甲醛有上述的優點,但這都是相對而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有許多缺點:1. 雜質含量較多,如甲醇,可鈍化酶類,影响反應.2. 含有微量甲酸,導致固定液酸變,影響染色.3. 可產生福馬林色素,影響觀察4. 不能固定尿酸和糖類物質.5. 容易揮發,污染環境.6. 會可長期存在於固定過的組織上.

醫療院所中甲醛的使用 (一)、組織固定 • 組織固定作業是將開刀切下的組織，置於透明固定盒（見圖左）或夾鍊袋中（見圖右），送到福馬林放置場所加入福馬林，或者將切下的組織放在已裝有福馬林的盒中。組織固定作業暴露時間極短，約在數秒鐘左右，主要作業場所為手術室、少數為動小手術的門診處，暴露人員以護士為主，少數為醫生，甲醛發生源主要來自福馬林傾倒時的洩漏及其溢散。

(二)、器械消毒（破壞蛋白質氫鍵或氨基） • 器械消毒作業是將欲消毒的器械置於放有固體或液體福馬林的燻箱內，見圖，藉由揮發之甲醛氣體燻蒸器械，達到消毒的目的。放置燻蒸時間視各醫院習慣而定，更換甲醛則不論液體或固體皆以三個月為期限，主要作業場所為手術室，暴露人員以護士為主，甲醛發生源主要來自換藥及取放消毒器械時福馬林的接觸、溢散。圖(1)為簡易型器械消毒例，裝甲醛水溶液的器皿是實驗室常用的乾燥器（desiccator），以消毒內視鏡為主。圖2為甲醛燻蒸箱，可以設定加熱溫度。

(三)、組織修剪 • 組織修剪為影響病理檢查的關鍵步驟，作業程序是工作人員將固定之組織取出，切下欲製作標本的部份，置於包埋盒中，見圖2.3。每日修剪組織的時間視該日樣本的多寡而定，一般分上下午兩次，每次時間約在1~2小時。組織修剪暴露的人員以醫生為主，其次為技術員。甲醛發生源主要來自組織取出與修剪時及修剪台上未加蓋容器中福馬林的溢散。

(四)、洗腎機的清洗 以2%甲醛溶液消毒去離子機滲透膜，清洗頻率以每月一次為原則。暴露人員以維修人員為主。 (五)、糞便寄生蟲檢驗 MIF(merthiolate-iodine-formaline )濃縮集卵法使用的MIF染色液配方為15份MF儲存液：1份魯氏碘液配製而成，其中MF儲存液的配方為3份福馬林加1份甲醇(即染色液的甲醛濃度約為26%)。糞便前處理時每一糞便檢體加4cc MIF染色液及3cc乙酸乙酯，此項檢驗工作主要是檢查糞便中的阿米巴原蟲及蟲卵。暴露的工作人員以技術員為主。 (六)、其他其他可能接觸甲醛之作業，如：10％福馬林工作液的配製，少數感染性病房的地板清潔…等等。

甲醛的健康危害 • 甲醛進入人體的途徑有吸入、食入、皮膚及眼睛接觸。吸入對人體健康影響方面，甲醛濃度低於0.05ppm尚未有健康影響的報告，嗅覺閾值0.05~1.0ppm，0.05~1.5ppm有神經症狀發生，0.01~2.0ppm造成眼睛刺激，0.1~25ppm上呼吸道刺激或增加鼻塞情形，5~30ppm則有下呼吸道、呼吸困難或慢性肺部阻塞，50~100ppm肺水腫或肺炎，100ppm以上則有死亡報告。 • 食入30mL福馬林液體會導致死亡，少量則會傷害喉嚨、胃和腸，導致反胃、嘔吐、疼痛和下痢。 • 皮膚直接接觸福馬林液體，會引起刺激、腐蝕、灼傷，也可能造成過敏反應。皮膚接觸含0.5%甲醛酚醛樹脂已被證明引起嚴重的皮膚壞死(necrosisi)、呼吸的痛苦(respiratory distress)、心臟血管和腎臟毒性。臨床上，1982 Agathos 調查1976至1980年間醫事人員手部濕疹的114個個案，指出由甲醛引起者占21%(24個案例)，為使用化學物之最。1983 Hansen指出引起醫院清潔人員職業性接觸性皮膚病的化學物質，包括：甲醛、戊二醛、氯胺、鎳和橡膠…等。1988孫氏統計職業病門診中接觸性皮膚炎的患者，指出甲醛為常見致過敏物之一

動物試驗資料顯示，急性方面，貓和老鼠暴露在甲醛濃度700ppm下，分別於暴露8小時和2小時後死亡，大鼠的LC50為81ppm[1]，老鼠長時間吸入甲醛濃度14ppm的空氣將導致鼻腔癌，細菌和某些昆蟲試驗有生殖性危害 • 甲醛職業暴露標準各國有關甲醛職業暴露限值的規定，2000年美國工業衛生師學會(ACGIH)建議之容許濃度閾值沒有八小時容許濃度閾值(8hr-TWA)，只訂甲醛的STEL/CEIL(C）為0.3ppm，歸類為”疑似人類致癌物(A2：Suspected Human Carcinogen)”，意即實驗動物有致癌性，流行病學調查顯示尚未充分肯定人類的致癌風險性。美國職業安全衛生署（OSHA）8hr-TWA-PEL 為0.75ppm，STEL/CEIL(C）為2ppm。美國職業衛生研究所（NIOSH）八小時暴露限值(REL-TWA)0.016ppm，STEL/CEIL：0.1ppm，IDLH值為30ppm；蘇俄TWA為0.5ppm，STEL：0.5ppm，附”皮”字註記。德國(1991)容許職業暴露限值(MAK)為0.5ppm；每工作班次8次每次5分鐘之短時間暴露標準為1.0ppm；Group B致癌物；致敏性。日本8hr-TWA為0.5ppm；致癌物。澳洲(1990)8hr-TWA為1ppm；STEL：2ppm；疑似人類致癌物致敏物。世界衛生組織WHO(1989)規定任何時間不得超過0.8ppm，平均暴露濃度為0.25ppm。我國(1995)僅訂有最高容許濃度值1ppm

中數致死量－導致50％動物死亡的致死劑量(Lethal Dose,LD50) • 美國政府工業衛生師協會ACGIH(American Conference of Governmental Industrial Hygienists) • （美國）職業安全衛生署OSHA(Occupational Safety and Health Administration) • （美國）國家職業安全衛生研究所NIOSH(National Institute for Occupational Safety and Health) • 閾限值(Threshold Limit Values, TLVs)：空氣中有害物質的規定標準，乃用以減少暴露造成工人的健康危害。 • 時量平均濃度TWA(Time Weighted Average) • 容許暴露濃度值PEL(Permissible Exposure Limit) • 推薦暴露容許值REL(Recommended Exposure Limit) • 短期暴露容許值STEL(Short-Term Exposure Limit) • 立即對生命或健康有危險IDLH(Immediately Dangerous to Life or Health)

1.應用甲醛配製之固定液: • (1) 10%緩衝福馬林固定液甲醛 100ml蒸餾水 900mlNaH2PO44gNa2HPO46.5g • 該固定液是當今流行的固定液,因它對組織固定較好,损傷較少,因對其後的各方面的研究都較好,尤其是對免疫組織化學的染色與鑑定 • 適用於血紅素與含鐵血紅素之固定，會抑制福馬林色素之生成 • 特別適用於黏多醣(mucopolysaccharide)染色與鑑定。

（2）10%福馬林固定液甲醛100 ml自來水900ml這是一種最簡單的固定液，適合於偏遠地區携带或組織郵寄使用的固定液。會使組織產生外來色素，其來源為血紅素形成之暗褐色或黑色結晶，一般不建議使用。（3）10%福馬林鈉鹽固定液甲醛 100 ml自來水 900mlNaCl 9克先將NaCl溶於水，再加入甲醛。這也是一種較為簡單的固定液，但由於加入NaCl，它是一種金屬鹽類物質，加入了它可保護脂類，促進並改善染色，增加染色的强度。

（4）Formalin Ammonium bromide solution(FAB) Formalin(37%-40%) 15ml Ammonium bromide((NH4)Br) 2gm 去離子水 85 ml 此溶液適用於中樞神經系統，尤其是金與銀侵透法更為適用（5）Alcoholic formalin 10% Formalin(37%-40%) 15ml 80% Alcohol 90 ml 福馬林以乙醇稀釋可快速固定節省一半的時間。 Alcoholic formalin 可保存肝醣，但會溶解脂肪組織與類脂肪組織。亦不適用於保存含鐵之色素。

(6）Bouin氏固定液苦味酸（Picric acid）飽和水溶液75 ml甲醛2 ml冰醋酸5 ml • 該固定液中的冰醋酸，對膠原纖維等組織有膨脹作用。而甲醛對組織有收缩作用。两種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用。使組織固定達到到優良的效果。 • 溶液穩定可做為保存液 • 此固定液亦可作特殊之研究 ( 如肝醣之固定 )，它的穿透作用及固定效果皆佳。其含有醋酸用於水產動物如蝦之固定，對軟化蝦體表之幾丁質有極佳之效果。但要注意於固定完成後，用 50% Alcohol 數次洗滌，搖動約 4-6 小時，以確定苦味酸之除去，再儲存於 70% 之酒精中。若不除去苦味酸，則染色會受影響，傷害正常之組織。

2.酒精（Alcohol）： 又稱乙醇，為無色透明的液體，沸點是78℃，工業酒精是95%。酒精它有許多優點： 1、可保存尿酸結晶和糖原等物質。高濃度的酒精如95%，無水酒精可保存上述两種物質，因它們易溶於水，因此要證明上述两種物質的存在，就不能用含水的固定液來固定組織。2、能在任何比例的情况下與水混合，在病理技術中，酒精是一種十分重要的試劑，它有著關鍵的作用。如果没有酒精，將無法完成必要的工作。如組織的脱水，切片染色前後都離不開酒精，在常规的工作中，通常都用95%的工業酒精來配成60%、70%、80%、90%等不同的濃度來使用。3、可溶解苯類物質為染色步骤中的橋樑試劑。常规檢體等切片上的石臘必須除去，才能進行染色，能除去石臘的物質有苯及汽油等，常用的有苯類試劑，苯不溶於水，但能溶於酒精，酒精在這裡充當著除去苯和水的作用，因此稱他為橋樑試劑。

4、能除去切片上的水份，使切片無水化。切片經染色後，由於所用的試劑都為水溶液，因此在切片上含有大量的水份，這些水份經系列梯度酒精的置换吸附後，到無水酒精中已完全無水，這樣處理對於切片的保存是有好處的，否則，切片將會褪色。5、可用來保存標本。大體標本經福馬林固定後，如　須陳列保存，必須取出冲冼。然後移入75%的酒精中。如果用福馬林作陳列標本的固定液，則因福馬林含有雜質較多，液體容易酸化，時間ㄧ長，會逐漸變為微黄色或淡黄色，影響美觀，影響陳列的效果。 6、可與其它試劑配成多種的混合固定液，有時為了了加快固定，常採用酒精和其它試劑來配成混合固定液，這種固定液在固定的同時，兼有對組織织脱水的作用。

酒精也有許多缺點：1、 可溶解脂類物質，凡要證明組織是否含有脂類和類脂物時，不能用含有酒精的固定液去固定，也不能用石臘切片，因為酒精可將它們溶解，而石臘切片組織中含有的脂類物質，则在組織脱水時被溶解，只留下脂類或類脂物所占有的空間。2、對組織收縮較大，不宜作單纯固定液。高濃度的酒精，對組織有顯著的收縮作用，造成組織變硬易脆，難以切片等現象。因此它不作為單純的固定液。3、渗透力不强。當用酒精固定組織時，組織表面很快就被固定，並形成了一層蛋白膜，這層膜可阻擋固定液向裏渗透，造成了中間組織固定不佳的現象。

4、可沉澱白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡經酒精固定的組織，核的染色都不好。5、可脱去切片上已著染的各種颜色，切片經染色後，一是必須洗去多餘的染液，二是必須脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必須仔细地掌握顯微镜下觀察，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水時，要較快地通過低濃度的酒精，以免使已著染的颜色被脱去。6、價格較貴。以經濟學的角度，應用酒精固定組織划不來，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例標本需要100ml計算，可固定50例標本，而一瓶 500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例標本，因此，若用酒精固定組織，其價格比用甲醛固定組織的要高8倍。

應用酒精配成的混合固定液有： (1) Carnoy氏固定液氯仿 300ml冰醋酸 100 ml 95%酒精 600 ml • 該固定液固定組織快速。溶液中的氯仿和酒精，對組織的收縮較厲害，但應用了冰醋酸，這種現象便被中和。 • 固定組織常用5%的溶液，能沉澱核蛋白，不能沉澱白蛋白、球蛋白，不能保存糖，也不能固定脂質，可使染色體保存較好。其穿透力強，滲透快。其缺點是使組織膨脹，特別對膠原纖維及纖維蛋白，高濃度的醋酸易破壞線粒體和高爾基體。

(2)AF固定液甲醛 100 ml冰醋酸 50 ml95%酒精 850 ml • 這種固定液的作用與上液有相似之處，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脱水用具不能使用銅製的脱水盒，因冰醋酸跟銅離子起反應，生成醋酸銅，這種物質可沉澱於組織間，會破壞組織中的抗原，造成免疫組織化學檢測的失敗。 • 酒精可以凝固蛋白質，能溶解大部分脂類。酒精滲透速度快。除了固定作用外，還具有硬化和脫水作用。缺點是滲透力差，能使組織收縮，易揮發，容易吸收空氣中的水分。酒精是一種還原劑，能被氧化成醋酸，不能與鉻酸、鋨酸及重鉻酸鉀等氧化劑配合成固定劑。AF液兼有脫水作用，對皮下組織中肥大細胞固定好。

3.冰醋酸(Acetic acid) 冰醋酸為無色透明的液体，易揮發，氣味大，純醋酸在17℃時常為結晶狀，因稱為冰醋酸，在冬天使用時，可用微波爐進行解凍，再行使用，它的優點有： 1、能迅速固定染色質，助於染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均匀，對於染色質的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明礬蘇木素和伊紅時，常常需加入一定量的醋酸，以促進染色。2、能使組織尤其是富含纖維的組織膨脹。各種固定液對組織都有收縮的作用，尤其是對富含纖維的組織。它不但不會使組織收縮，而且還會令許多組織發生膨脹的作用。根據這個特點，用它配成許多種不同的混合固定液，以達到固定好，收縮少，易切片，效果好等目的。

冰醋酸也有許多缺點： 1、不能作為單一的固定劑。冰醋酸在實際應用中，常被作為添加劑來使用，如許多種固定液，都加入了冰醋酸。 2、不能凝固蛋白質，不能保存细胞颗粒，紅血球細胞及含血鐵黄素等。3、價格較貴

用它配成的混合固定液有： （1）Zenker氏固定液：重鉻酸鉀 25G升汞（氯化汞）50G蒸餾水 1000ml冰醋酸 50ml • 先將重鉻酸鉀和升汞溶於水中，尢其是重鉻酸鉀，應用熱水或加温的方法將其溶解，然後過濾儲存於有蓋的玻璃瓶中，如暴露於空氣中，該溶液將會被慢慢氧化而便颜色加深，導致失效。使用時，取儲存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。 • 應用該固定液固定的組織，一般不要超過24h，取出組織，流水冲冼12小時以上，然後保存於75%-80%的酒精中，在切片染色前，必須用碘除去汞鹽的沉著。應用該固定液的組織，細胞核及细胞質染色十分清晰，特别是要顯示骨骼肌的横纹時，應用本液可獲得满意的结果，但由於其含有醋酸，故不能用於保存細胞颗粒，紅血球細胞及含鐵血黄素。

重鉻酸鉀是強氧化劑，適合固定材料的濃度為1-3%，可使蛋白質產生沉澱。能固定類脂體，固定高爾基體、粒線體、脂肪。能溶解染色體，所以對核染色不良。重鉻酸鉀是強氧化劑，適合固定材料的濃度為1-3%，可使蛋白質產生沉澱。能固定類脂體，固定高爾基體、粒線體、脂肪。能溶解染色體，所以對核染色不良。 • Zenker固定液對細胞質固定好，顯示某些細胞質內特殊顆粒有獨特優越性，對胰島和垂體前葉各種細胞的顯示效果好。

Fixation of tissue ( 組織固定 )