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Agilent 1100 纯化系统. 制备液相的操作. 分析型液相与制备型液相的区别 (半)制备液相方法的建立 制备液相操作技巧及注意事项 Agilent 1100 样品纯化解决方案介绍. 种类. 柱内径. 典型流速. 开管液相色谱(纳流液相色谱). < 20 µ m. < 50 nL/min. 毛细管液相色谱. 0.1~ 1mm. 1 ~100 µ L/min. 微孔液相色谱. 1 ~2 mm. 100 ~ 500 µ L/min. 小口径(窄口径)液相色谱. 2 ~ 3 mm. 500 ~ 1500 µ L/min.
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制备液相的操作 • 分析型液相与制备型液相的区别 • (半)制备液相方法的建立 • 制备液相操作技巧及注意事项 • Agilent 1100 样品纯化解决方案介绍 Agilent Restricted
种类 柱内径 典型流速 开管液相色谱(纳流液相色谱) < 20 µm < 50 nL/min 毛细管液相色谱 0.1~ 1mm 1 ~100 µL/min 微孔液相色谱 1 ~2 mm 100 ~ 500 µL/min 小口径(窄口径)液相色谱 2 ~ 3 mm 500 ~ 1500 µL/min 常规液相色谱 3~5 mm 1.5 ~ 5 mL/min 半制备液相色谱 5~10 mm > 5 mL/min 制备液相色谱 > 10mm > 10 mL/min HPLC术语 Agilent Restricted
高压制备 可使用与分析柱相同的细粒径填料,柱效高,组分分离度高; 分离重现性好; 节约分析时间及成本。 中/常压制备 只能使用较粗的填料,柱效低,对组分的分离度有限; 分离影响因素多(柱装填的均匀性,柱效,填料质量,流量稳定性及准确性等); 时间消耗多。 高压制备与中/常压制备的比较 Agilent Restricted
分析液相与制备液相的比较 • 制备型液相 • 目的:组分的分离纯化 • 半制备液相 • 流速较低 (< 10 ml/min) • 柱内径较小 (< 10 mm) • 制备液相 • 高流速 (> 10 ml/min) • 柱内径大 (> 10 mm) • 系统管线(0.5mm, I.d) • 低流速将导致更大的扩散 • 流通池光程 (3、0.3 或 0.06 mm) • 避免检测器的饱和,灵敏度降低,便于增加进样量 分析型液相 目的:组分的定性定量 低流速 (< 2 ml/min) 色谱柱内径小 (< 5 mm) 系统管路 (0.12~0.17 mm I.d) 流通池光程 (5~10 mm) Agilent Restricted
纯化过程 溶剂提取 结晶 常压和/或中压色谱分离 复杂样品纯化 不同的组分群 N 目标组分达到一定含量及纯度要求 Y 高压制备分离纯化 Agilent Restricted
1 优化分析方法: 对目标制备组分的分离度控制在 1.5~3之间 mAU 300 分离度 1.5 ~ 3 250 200 150 100 50 0 min 5 10 15 20 25 30 液相制备的工作步骤 Agilent Restricted
Vinj 样品分析 Vinj Vinj 体积过载 Vinj Vinj 浓度过载 在分析柱上进行过载试验 色谱柱的过载 2 Agilent Restricted
mAU 5000 4000 3000 2000 1000 0 分析柱上的过载试验 进样量 500 µg each 250 µg each 25 µg each 2.5 µg each 0.25 µg each 0.025 µg each 2 4 6 8 10 12 14 min Agilent Restricted
制备放大的计算 分析柱: Zorbax SB-C18 3x150 mm, 5 µm 流速: 0.6 ml/min 进样量: 500 µg 制备柱: Zorbax SB-C18 21.2x150 mm, 5 µm 流速: ~30 ml/min 进样量:25 mg CL = 柱长比 = 1 V1 = 分析柱的流速= 0.6 ml/min x1 = 分析柱最大上样量= 500 µg r1 = 分析柱内径= 1.5 mm V2 = 制备柱的流速=? x2 = 制备柱最大上样量=? r2 = 制备柱内径=10.6mm Agilent Restricted
mAU 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 min 制备放大试验 Agilent Restricted
影响硅胶填料反相色谱柱性能的参数 • 硅胶类型: 不定形硅胶,球形硅胶柱容量,充填均匀度 • 硅胶纯度: 金属含量,填料酸性峰形 • 填料颗粒尺寸:粒径大小分布,均匀度充填均匀度,流速相关性 • 填料孔径: 7~12nm,30nm适用的化合物分子量范围 • 键合密度: 含碳量容量因子,保留时间 • 键合方式:键合相修饰 选择性,水性流动相的耐受性 • 柱填料量:柱床实密性 柱容量 • 封端技术: 屏蔽硅醇基, 碱性化合物的峰形,选择性 • 消除二次化学平衡效应 因此,并非所有C18柱都相同, 分析柱和制备柱应选择相同的填料!!
产量:进样量, 组分收集参数设定 浓度,体积,样品溶解性能,组分含量,回收率,柱容量 10 min 产量 纯度:分离度 柱效,进样量,分离条件 通量:分析时间 分离条件,样品复杂程度 通量 纯度 30 min 6 min 制备参数的关系 Agilent Restricted
制备产率 产量=样品浓度进样体积组分含量收集回收率累积次数 样品浓度:化合物的溶解性能(溶剂、温度、样品纯度等) 进样体积:柱容量,流通池设计 收集回收率:分离条件,组分收集触发参数的设定 累积次数:分析时间,容器的容量 可使用3.0~50mm内径的色谱柱,分析和制备在同一套系统上完成,便于方法的建立和转换;每次进样“产量”与多种因素相关,用户可通过多次进样,以及累积收集功能,获得纯度及产率满意的纯化合物。 Agilent Restricted
mAU 高压混合梯度 低压混合梯度 1000 800 滞后时间 600 400 延迟体积:二元泵 400uL 四元泵 1000uL 梯度起点 200 0 0 5 10 15 20 25 min 梯度延迟体积 建议:测定不同系统的延迟体积,并通过调节梯度的起始时间,以便在不同仪器上获得重现的色谱图 Vdelay=Vmixer+Vpre-column
梯度曲线 1100 制备泵 1600 5 1400 2 1200 3 1000 4 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 min 相对延迟 2 梯度曲线 1200 其它制备泵 3 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 min 柱前延迟体积的影响 因此,在不同系统之间进行方法转换,需分别测定系统延迟体积 Agilent Restricted
UV检测器 MS检测器 组分收集器 柱后延迟体积对自动组分收集的影响 由于管线连接的不同长度,流分到达组分收集器的时间将与信号被检测的时间(保留时间)存在不同的滞后,如果根据保留时间收集将导致组分收集的错误甚至缺失,因此,进行延迟体积的校正是非常必要的。 Agilent Restricted
延迟体积的自动计算及校正 Calc Delay Vol. 384L Agilent Restricted
mAU 4.244 4.800 2500 254nm 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min mAU 4.242 4.820 205nm 2000 3.276 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min 检测波长影响 严重干扰组分纯度及产率 波长选择不当 分离度 组分交叉收集 Agilent Restricted
mAU 6.423 7.168 2500 分析柱:Zorbax XDB C18 4.6250mm 进样量:10mg/mL150 L Inj. 10mg/mL, 150uL 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 min mAU 4.244 4.800 2500 制备柱:Zorbax XDB C18 21.2150mm 进样量:40mg/mL400 L 254nm 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min 用户应用实例 分析进样量:1.5mg 理论计算 制备进样量:20mg 或相同浓度进样体积:2mL 溶解度及进样体积限制 每次进样16mg Agilent Restricted
样品纯化技巧以及注意事项 • 尽量采用浓度过载方式上样:有利于防止因样品在柱头扩散而降低柱效; • 所有连接管线,尤其柱后管线尽可能短,避免不必要的峰扩散,影响收集效率; • 采用装填细粒径填料的制备柱(7m或5m ),保证良好的柱效,高分离效能,缩短分析时间; • 准确设定组分收集的触发参数,避免因收集位点的偏移影响组分纯度及产率; • 采用高质量的溶剂作为流动相:防止溶剂中带入不可知的杂质; • 注意所有容器的洁净度,防止不可预知的杂质污染。 Agilent Restricted