ASIGNACIÓN SECUENCIAL DE PÉPTIDOS Y PEQUEÑAS PROTEÍNAS MEDIANTE RMN DE 1 H

1. ¿Qué se entiende por asignación secuencial de una cadena polipeptídica? La obtención de la frecuencia (o desplazamiento químico) de cada núcleo de cada residuo específico de la cadena. ASIGNACIÓN SECUENCIAL DE PÉPTIDOS Y PEQUEÑAS PROTEÍNAS MEDIANTE RMN DE 1H EL PÉPTIDO DE 20 RESIDUOS “Twenty” KTLTLEAALRNAWLREVGLK Espectro 1D-RMN Objetivos: 1. Obtener la asignación secuencial. 2. Predecir la estructura secundaria. 3. Determinar la estructura tridimensional Conjunto de espectros disponibles: COSY, TOCSY mezcla larga, NOESY 80 ms. Todos ellos en agua ligera.

2. ESPECTROS NECESARIOS PARA ASIGNACIÓN SECUENCIAL * COSY o DQF-COSY o TOCSY mezcla corta (tmezcla 25-30 ms) * TOCSY mezcla larga (tmezcla  70-80 ms) * NOESY Evaluación de calidad de los espectros: Observar la “huella dactilar” de los espectros COSY (F2: 6.5-10.5 ppm; F1: 2.5-6.5 Ppm) Contar el número de picos de cruce. Este número debe aproximarse al número de residuos de la cadena. Causas de la falta de picos de cruce en el COSY: 1: Saturación de señales bajo la señal del agua. Soluciones: Scuba-COSY o watergate con gradientes, cambio de temperatura de trabajo). 2. Saturación cruzada por intercambio rápido entre los protones amida y el disolvente. Soluciones: secuencias con jump-return, trabajo a pH ligeramente ácido). 3. JNH-H pequeño o anchura de línea grande. Soluciones: sustituir COSY por TOCSY (tmezcla 25-30 ms). Tratar de disminuir viscosidad (↑T o ↓concentración). Calidad del espectro NOESY: Debe contener un número suficiente de picos de cruce NH-H y NH-NH. (Depende del tiempo de mezcla). Hay que evitar la difusión de spin (experimentos de crecimiento de NOEs).

3. TOCSY NOESY 80 ms

4. HUELLA DACTILAR DEL DQF-COSY Picos de cruce: 20 Picos de cruce esperados: ¿?

5. SISTEMAS DE SPIN Sistema de spin: Conjunto de núcleos (1H) acoplados escalarmente directa o indirectamente entre sí. Hc Conexión indirecta H H H H Ha Hb Acoplamiento geminal (dos enlaces) J ~ -12 to -15 Hz Acoplamiento vecinal (tres enlaces) J ~ 2-14 Hz ejemplo de un Sistema de spin En cadenas polipeptídicas cada aminoácido presenta uno o más sistemas de spin de protones por separado.

6. INDENTIFICACIÓN DE SISTEMAS DE SPIN EN AMINOACIDOS COSY produce picos de cruce entre resonancias con acoplamiento escalar a través de 2 ó 3 enlaces (circulos abiertos). TOCSY produce picos de cruce entre todas (o casi todas) las resonancias que forman cada sistema de spin (circulos abiertos + asteriscos). Los patrones de picos de cruce COSY y TOCSY, junto con información cualitativa de desplazamientos químicos permiten la identificación de los sistemas de spin.

7. EJEMPLO DE UN SISTEMA DE SPIN TIPICO DE LISINA CO HN Hd e NH3+ a b g d Ha He Hb Hg Hg Hd Hb He Ha

8. FUENTES DE INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SISTEMAS DE SPIN • Patrones típicos de picos de cruce en TOCSY y COSY para cada sistema de spin. • Forma de las señales COSY (constantes de acoplamiento, J). • Desplazamientos químicos típicos. • Intensidad de los picos de cruce. GRUPOS DE SISTEMA DE SPIN PARA IDENTIFICACIÓN: Tipo Presentes en Twenty • Gly (1 Gly) • Ala, Thr (3 Ala, 2 Thr) • Val, Leu, Ile (5 Leu, 1 Val) • Tipo J: Ser, Asp, Asn, Cys, Trp, Phe, Tyr, His (1 Asn, 1 Trp) • Tipo U: Lys, Arg, Met, Gln, Glu, Pro (Leu) (2 Lys, 2 Arg, 2 Glu) • Aromáticos. (1 Trp) • Tipo X.

9. PÉPTIDO PROBLEMA: ESPECTRO COSY. Identificación de sistemas de spin de alanina y treonina. H N H H 1 3 N C2H3 H C C 1 2 H C CH3 C O1H 2 O C O Alanina 3 2 1 1 2

10. Identificación de sistemas de spin de alanina y treonina (Espectro TOCSY). Ala Thr

11. H N C2H3 1 3 H H C C 2 3 C C1H3 O PÉPTIDO PROBLEMA: ESPECTRO COSY. Identificación del sistema de spin de valina. 3 1 2

12. PÉPTIDO PROBLEMA: ESPECTRO 2D-TOCSY. Val17 Leu?

13. H N C2H3 H 1 3 2 4 C H C C H 2 3 4 H C C1H3 O PICOS DE CRUCE COSY PARA SISTEMA DE SPIN DE LEUCINA 4 3 4 1 2

14. SISTEMAS DE SPIN COMPLETOS DE LEUCINA Y TIPO J Leu Tipo J

15. PARTE DE OTROS SISTEMAS DE SPIN DE LEUCINAS

16. SISTEMAS DE SPIN COMPLETOS DE TIPO U Tipo U (K ó R) Tipo U (E)

17. PICOS DE CRUCE COSY PARA SISTEMAS DE SPIN DE TIPO U H N H 1 2 … H C C 2 H C O 1 2 1 2

18. TOCSY: identificación de sistemas de spin completa V17 V17 V17 V17 V17 L2 L1 L1 L2 L1 L5 L5 L2 L3 L4 L3 L4 L4 L3 T1 T1 T2 L5 L5 L5 U3 U3 L1 A2 T2 L5 A2 U3 U4 L1 L2 A3 U3 A1 L1 L1 A3 U4 L4 U2 U2 U4 U4 U2 A1 L3 L2 L2 L4 L4 L4 U4 U1 U3 U1 U1 U2 U3 U1 L1 U4 V17 V17 U1 L3 L3 L1 L1 U1 U1 U2 U2 U2 U2 V17 U2 U3 L1 L5 L5 E1 E1 U4 E2 U1 U4 U4 L5 U1 L5 E1 E2 E2 E1 E1 E1 E2 E2 E2 E2 J2 J2 J2 U3 U4 U3 U4 J2 U1 U3 U1 U1 U1 U4 U4 J1 U2 U2 U2 U2 J1 J1 J1 L5 L5 E1 E1 E1 G18 G18 V17 L5 V17 V17 U1 A2 E2 U1 L1 U1 A3 L1 L1 L1 A2 L4 L4 T1 T1 G18 U2 E2 J1 A3 U3 A1 T2 L4 U4 A1 U2 T1 U2 T1 U3 U3 J1 J2 T1 L2 T2 T2 L2 T2 L2 L3 L3 L3 J2

19. H3 1 2 NOE4 H3 C3 H2 C2 C3 H 3 C2 C2 C2 C C H2 NOE1 H C1 N1 4 NOE3 H1 H1 NOE2 SISTEMAS DE SPIN DE ANILLO AROMÁTICO DE W13 1 2 3 COSY TOCSY

20. H3 1 2 NOE4 H3 C3 H2 NOE2 C2 C3 H 3 C2 C2 NOE1 C2 C C H2 NOE1 H C1 N1 4 NOE3 H1 H1 NOE2 SISTEMAS DE SPIN DE ANILLO AROMÁTICO DE W13. NOESY

21. H3 1 2 H3 C3 H2 C2 C3 NOE4 3 C2 C2 C2 CH2 C H2 C1 N1 NOE1 NOE3 4 H1 H1 NOE2 NOE4 W13 CONEXIÓN SISTEMA TIPO J CON ANILLO EN W13. NOESY NOE2 H1 H2 NOE1 H1