Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données "

1. Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données  " Intérêt des bases de données pour la spéciation des actinides en milieu biologique Application à la toxicologie nucléaire E.Ansoborlo V.Moulin, C.Moulin, L.Bion, P.Moisy, C.Madic, G.Cote Programme de Toxicologie Nucléaire

2. Plan de l’exposé • Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire • Besoins de spéciation en Biologie • Etat des connaissances Actinides-Biologie • Eléments et milieux d’intérêts • Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"  • Exemples d’application • Perspectives

3. 1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire Eléments d’intérêt : Actinides, PF, PA Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie) Dosimétrie Interne Toxicité chimique Modèles CIPR Programme ToxNuc-E

4. 1.1 Modes de contamination : CIPR Incorporation Métabolisme Organes cibles Excrétion

5. 1.2 Programme de Toxicologie Nucléaire Programme inter organismes (CEA-CNRS-Inserm-Inra) Programme multidisciplinaire : physique, chimie, biologie, biochimie, médecine… 2 orientations : Homme et Environnement Cibles moléculaires des actinides Toxico-cancéro,neurotoxicité, génotoxicité Décorporation des actinides Transporteurs membranaires, stress oxydant Spéciation en milieu biologique

6. Niveau cellulaire transporteur protéines élément chimique ? Molecules cibles Mécanismes de protection/detoxication Spéciation Effets sur physiologie cellulaire ADN MOX U+Pumacrophage pulmonaire Regulation génétique réponses Précoces/ tardives Toxicité chimique et /ou Toxicité radiologique

7. 2. Besoins de spéciation en Toxicologie Nucléaire • Dimensionner les expérimentations • Comprendre les mécanismes de transfert ou rétention • Préparer et interpréter les études Décorporation

8. 3. Etat des connaissances Actinides-Biologie

9. 3.1 Bases de données existantes • Radionucléide Database (Inhalation, ingestion…) : Données biocinétiques(absorption sang, ingestion…) • Base de données décorporation (en cours DSV/CARMIN) Familles de ligands, efficacité décorporante, Cst… • Base de données toxicologiques (DEN/DSV) : comparaison Toxicologie/radiotoxicologie

10. 4. Eléments et milieux d’intérêts Eléménts Milieux Familles ligands Sang Salive Sucs Gastriques Urine Lait Mat-fœtal Macrophages… Milieux Culture • Minéral • Organique • Acides aminés, Protéines • Sucres • Cations base • décorporants • Actinides (Th, U, Np, Pu, Am…) • PF (Cs, Sr, I, Tc, Se…) • PA (Co, Ni…) • Toxiques (Cd, Be…) Paramètres variants : C, pH, I, Redox +précipitation

11. Exemples de composition de milieux d’intérêt

12. Acide de Lewis (Pearson) intermédiaires cations durs cations mous Hg Cd Ag Cu(I) Pb Zn Cu(II) Co Fe(II) Fe(III) Mn Ca Mg Cs Sr U Thiolates (S) Imidazoles (N) Carboxylates (O) Cystéine Glutathion Metallothionéine… Acide aspartique Acide glutamique Glycine, Tyrosine… Transferine… Acides aminés protéines Carbonyles Cahier des charges Métal/ligand

13. Cahier des charges Actinides/ligands Contraintes Ligands • Atomes donneurs O>N>S • Denticité ou Nb de sites donneurs • Stéréochimie du ligand, taille • Stabilisation (liaisons H) • Sélectivité/(Na+, Ca2+…) • Ionisé au pH physiologique • Hydrosoluble • Cinétique et thermodynamique • Ratio Chelatant:métal (>1000:1) • Toxicité et AMM (autorisation) Actinides • Cations durs (Pearson) • Degrés d’oxydation 3 à 6 (Am3+, Np4+, NpO2+, Pu4+, UO22+) • Aptitude hydrolyse M4+> MO22+> M3+ > MO2+ • Redox (ex : Np(IV), Np(V)) • Nombreux complexes (OH-, H2PO4-, HCO3-) • Cinétique de dissociation des complexes stables lente

14. 5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation" Crée en 2000 avec 2 sous-groupes Bases de données (L.Bion, G.Cote) Méthodologie (D.Doizi) Objectifs Incrémenter Bases de données (BASSIST) Organisation d ’exercices intercomparaisons Production 1 Note technique " Spéciation "/an Réalisations Bases de données : U, Pu, Am, Np Notes techniques "Spéciation" : U, Pu, Co, Tox Production 1 Note technique Spéciation/an Workshop (2001, 2004), Publication (RCA)

15. 5.1. Etat des lieux données : ex Actinides Sources Familles ligands Etat des données NEA/OCDE PSI IUPAC Smith-Martell NIST IRSN Publications • Minéral • Organique • Acides aminés, Protéines • Sucres • Cations base • décorporants • OH-, HCO3-, HPO4=, SO4=… OK • Citrates… (Expertise) • Données(Exp) manque données • manque données • Données(OK) • qq données (Exp)

16. 5.1. Etat des lieux données : ex Actinides

17. 6.1. Exemple d’application des bases de données • Spéciation des actinides dans le sang • Précipitation intracellulaire de l’uranium (rein) • Répartition différente de 3 espèces Pu (foie)

18. Spéciation actinides dans le sang Pu4+ Am3+ Np02+ U022+

19. Spéciation actinides dans le sang Pu4+ Th4+ Np4+ Np02+

20. Précipitation intracellulaire de l’U (rein) Phosphore Uranium Spéciation théorique Uranium sous forme bicarbonate [U]=8x 10-4M Précipités d’uranium / cellule LLC-PK1 (x 80000) Spectre analyse X (EDAX)

21. % activité injectée 90 238Pu-cit 80 239Pu-nit 70 239Pu-phyt 60 50 40 30 20 10 0 1 7 14 30 90 Temps (jours) Rétention hépatique de différentes formes chimiques de Pu au cours du temps après contamination I.V.

22. 6.2. Exemple de détermination de Constantes thermodynamiques • Spéciation du Neptunium dans le sang • Décorporation de l’U par un Biphosphonate (EHBP) • Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine

23. Exemples Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001) Nombreuses manip in vivo sur Np(IV) et Np(V) Dans le sang Np sous 2 formes Np02+ NpO2+ libre + NpO2HPO4- + NpO2CO3- Np4+ lié à la transferrine (log K1~22) Dans l’os sous 1 forme :Np4+ Np4+ lié hydroxyapatite Np4+ Np4+ en milieu citrate partiellement oxydé

24. Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001) Np4+ NpO2+

25. - Nombreuses études biologiques :Hoffschir (2000) Hengé-Napoli (1999) Ubios (2001) Caractérisation du complexe UO22+ - EHBP - Famille des diphosphonates - Possède une AMM (maladie de Paget)

26. Titration à pH = 2 [UO22+] = 4.10-5 M [EHBP]= 0 à 5 équiv. Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log b = 6.0 ± 0.4 MH2L log b = 11.0 ± 0.6 Complexe UO22+-EHBP par ES-MS SLRT En accord avec Nash* log  = 11.76 ± 0.01 (extraction) ESI-MS Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log b = 6.0 ± 0.6 Confirmation de la stœchiométrie du complexe 1 : 1 m/z = 673-677 [(UO2)(H3L)(ClO4)2]- pH 2 m/z = 679 [(UO2)(H2L)(H3L)]- pH 4 *Nash K. L. Radiochimica Acta 1993, 61, 147.

27. Matrice biologique Sang, peau, foie Etudes cellulaires in vitro  Toxicité du Cosur leskératinocytes • Spéciation du Co dans les lignées d’hépatocytes (prgm décorporation) Matrice environnement Sol, plantes, systèmes aquatiques…. • Fixation du 57Co dans les sols • Phytoextraction de cellules végétales (prgm transfert sol plantes) Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine Matrices simples pour étude fondamentale via plate forme spectroscopique Co-Citrate, Co-Cystéine, Co-EDTA (référence)

28. Utilisation sous forme d’acide citrique pKa1 = 3.14 pKa2 = 4.77 pKa3 = 6.39 • Etude en ES-MS et CI-ICP/OES: Stoechiométrie 1/1 • Confirmation de la constante de complexationCo(II)/Cit: Log b1 = 4.5  0.4 • Pas d’observation du complexe Co-Cit en raison de son caractère labile • Résultats en accord avec la littérature (A. A. Ammann, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 205) Le ligand citrate: acide organique • Ligand très abondant dans les milieux biologiques et environnement • Sang : 10-4M • Solubilisationdes métaux : transport et biodisponibilité • Peu de données concernant le système Co-Cit (1/1) en milieu aqueux

29. pKa (COOH)= 1.82 pKa (SH)= 8.24 pKa (NH3+)= 10.36 DH2 Présence de O2: oxydation de la cystéine 2RSH RSSR + 2H+ + 2e- (favorisée en milieu basique) • Etude en ES-MS: Stoechiométrie 1/1 Le ligand cystéine: acide aminé • Rôle important dans la structure des protéines via sa fonction SH • Peu de donnéesrécentes concernant le système Co-Cyst (1/1) en milieu aqueux • Activation sélective des sites: étude enfonction du pH • Phénomènes rédox inhérents au couple Co3+/Co2+

30. Etude du système Co – cystéine Spéciation par ES-SM Diagramme obtenu expérimentalement % des espèces Co(III)Cyst2 Co(II) libre A intégrer dans les outils de spéciation théorique type JCHESS Co(II)Cyst Co(II)DH2 Complexe 1-1 avec la cystéine majoritaire à pH5 Complexe avec la cystine (dimère) à pH neutre Complexe 1-2 avec oxydation de Co à pH basique "La spéciation du Co dans le domaine de la toxicologie nucléaire: milieux environnementaux et biologiques". NT CETAMA 02-07. E. Ansoborlo et al.

31. 7. Perspectives • Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation Thèse Np-Pu/transferrine aspect redox (P.Moisy, 2004) Thèse Pu-protéines ES-MS (C.Moulin, 2004) • Poursuite travaux GT 32 : intercomparaison Tc Note spéciation Np Publi intercomparaison Am (L.Bion) Intercomparaison solution U, phosphates, citrates • Participation CDTP école des mines • Organisation 2ème Workshop spéciation Institut Curie (15-16 Novembre 2004)