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Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid

Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid. To resolve two problems ： 1. 核苷酸序列如何保证准确无误？ 2. 3  ， 5  -  二酯键如何形成？ 模板 酶 RNA 引物 ———> DNA dNTP. Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid. DNA 的合成 ( 复制 ) DNA 的损伤和修复 RNA 的合成 ( 转录 ) RNA 生物合成的抑制剂 逆转录作用 基因重组与 DNA CLONE.

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Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid

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Presentation Transcript

  1. Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid To resolve two problems ： 1. 核苷酸序列如何保证准确无误？ 2. 3，5- 二酯键如何形成？ 模板 酶 RNA引物 ———> DNA dNTP

  2. Chapter 10 Biosynthesis of nucleic acid • DNA的合成(复制) • DNA的损伤和修复 • RNA的合成(转录) • RNA生物合成的抑制剂 • 逆转录作用 • 基因重组与DNA CLONE

  3. 第一节 The biosynthesis of DNA 一、DNA半保留复制(Semi-Conservative Replication) • DNA的双螺旋模型(Watson & Crick, 1953) • DNA复制方式的实验证据(Meselson & Stahl, 1958) ——同位素15N标记E. coli DNA 特点： • SCR是双链DNA进行复制的主要方式，是一种普遍的复制机制； • 即使是单链DNA，也要变成双链DNA，再进行SCR； • 双解链开是复制的必要步骤； • 模板作用； • 碱基配对(新链形成)——核酸分子间传递信息的基础。

  4. 第一节 The biosynthesis of DNA 一、DNA半保留复制(Semi-Conservative Replication) 生物学意义： • 亲代DNA中始终有一条链保留在子代DNA分子中 ——遗传特性保持相对稳定谚语？Any applications? 二、复制单位 1.复制子：在基因组中能独立进行复制的单位。 复制开始的某一固定位置——起始点，是一含100-200 bp的片段。 复制开始时，起始点分开形成叉——复制叉。 NB 可能没有复制终点。

  5. 第一节 The biosynthesis of DNA 二、复制单位 2. 复制方向： • 大多数是双向进行的，形成两个复制叉。也有的是单向进行的。 • 通常为对称复制，也有不对称的。 3. 原核(包括真核细胞的线粒体、叶绿体)DNA与真核DNA比较 • 复制起始点 1个 多个 (n×103-n × 104) • 单个复制子的移动速度 快(105 bp/min) 慢(5×102-103 bp/min) • 复制的总速度 慢 快

  6. 第一节 The biosynthesis of DNA 三、原核生物DNA复制 (一). DNA聚合反应和聚合酶： 1. DNA的聚合反应 • 条件： 模板DNA 酶 引物RNA ——————> DNA 底物(dNTP) Mg2+、Zn2+ • 反应机理： 形成3，5- 二酯键；碱基配对形成氢键 <--cf two problems

  7. 第一节 The biosynthesis of DNA 三、原核生物DNA复制 (一). DNA聚合反应和聚合酶： • DNA聚合反应特点 除以上反应条件外，还有： a. DNA新链延长方向： 5 3(模板链从3 5 )—Key Point b. 新合成链与模板链的性质相同(与聚合酶来源无关)—meaning?

  8. 第一节 The biosynthesis of DNA 三、原核生物DNA复制 (一). DNA聚合反应和聚合酶： 2. DNA polymerase I (Kornberg et al, 1956) 单一多肽链的多功能酶 功能： a. 具有DNA 聚合酶活性(5 3) b. 3  5核酸外切酶活性(切除错配碱基，“校对”：单链核苷酸) c. 5  3核酸外切酶活性(切除引物RNA：针对双链核苷酸)—特有

  9. 第一节 The biosynthesis of DNA 三、原核生物DNA复制 (一). DNA聚合反应和聚合酶： 3. DNA polymerase II (1970S) 单一多肽链，活性低(仅为DNA polymerase I的5%)。 功能： 具有3  5核酸外切酶活性，无 5  3核酸外切酶活性 可能与DNA修复有关。

  10. 第一节 The biosynthesis of DNA (一). DNA聚合反应和聚合酶： 4. DNA polymerase III (1970S) 寡聚酶，亚基间非共价结构，易分离开来。 功能： a. 具有5 3DNA聚合酶活性，比DNA polymerase I高。 相对活力：I:II:III=1:0.05:50 b.具有3  5核酸外切酶活性，无 5  3核酸外切酶活性。 即II、III均无切除引物的活性。 ==>三种酶的共同点： 均需模板；base pairing； 5  3聚合；校对作用。(表10-2)

  11. 第一节 The biosynthesis of DNA (二). DNA ligase 功能：作用于切口。 需要能量(真核生物：ATP；原核生物：NAD+)。 cf 切口： 相邻的3-OH与5- 在连接酶的作用下连接起来。 若3- 与5- OH ，此酶不起作用。 缺口：倘中间缺少碱基，即使有3-OH与5- ，也不能连接起来。

  12. 第一节 The biosynthesis of DNA (三). primase & primosome 引物酶： dnaG基因编码的蛋白。是RNA聚合酶，合成RNA(作为DNA合成的)引物。 DnaG蛋白与辅助蛋白组装成引发体。

  13. 第一节 The biosynthesis of DNA (四). DNA helicase (解螺旋酶) rep基因编码的rep蛋白。 • 催化DNA双螺旋解链，提供单链DNA模板——复制和修复的前提。 • 每消耗2ATP，解开1 bp。其方向与复制叉一致。 SSB: (single-strand binding protein, 单链结合蛋白) 功能： • 避免解开的链恢复双螺旋结构——碱基暴露的单链模板 • 避免遭受核酸酶水解 • 降低DNA的解链温度(Tm值)

  14. 第一节 The biosynthesis of DNA (五). DNA半不连续复制： DNA复制过程中一条模板链合成的新链是连续的，方向5  3，另一条模板链的合成方向也是5  3，但合成的新链是不连续的。 1. 先导(leading)链：连续合成，有1个引物RNA。模板走向为3  5。 2. 滞后(lagging)链：不连续合成，有多个RNA。模板走向为5  3。 Okazaki fragment: 滞后链上的较小的DNA片段称冈崎片段 (Okazaki, 1968)。 原核生物DNA复制过程：起始、延伸和终止 (p273-275，略)

  15. 第一节 The biosynthesis of DNA (六).原核生物DNA复制过程： (p273-275，略讲) • 起始： 识别起始点结合，组成引发体DNA双螺旋解开合成RNA引物 • 延伸： polymerase III结合上去在3-OH后合成新的DNA链模板走向为35：leading and lagging strand (Okazaki fragment) • 终止： 复制叉到达终点ter site终止，由DNA polymerase I 补上空缺DNA ligase连接封口。

  16. 第一节 The biosynthesis of DNA 四、真核生物DNA复制： 许多方面与E. coli相似。但也有不同。 真核生物DNA聚合酶： • 有、、、四种，均是5 3聚合酶。 聚合酶——染色体DNA复制 聚合酶——DNA修复 聚合酶——线粒体DNA复制 • 、、无外切酶活性。具有5 3外切酶活性而无3-->5外切酶活性。 • 这四种聚合酶均无核对作用。

  17. 第一节 The biosynthesis of DNA 四、真核生物DNA复制： 比较 真核 原核细胞 DNA聚合酶 无外切酶活性 有 引物切除 RNA酶 DNA聚合酶I 起始位点 多个 1个 引物RNA 短(10 bp) 长(50-100 bp) Okazaki片段 短(100-200 bp) 长(1000-2000 bp) 连接酶反应供能 ATP NAD+ 共同点： • 均为半保留复制；均沿5  3延伸； • 复制既可单向进行，也可双向进行； • 复制可以是半不连续，也可以是不连续的。

  18. 第二节 DNA的损伤与修复 一、DNA的突变： 置换(转换和颠换)、插入、缺失 <略讲> 二、紫外线(UV)引起的DNA损伤 DNA链上相邻的嘧啶碱基形成嘧啶二聚体(dimer) 不能配对(与互补链上的嘌呤形成氢键)影响复制和基因表达 二、修复 光修复：较强可见光激活光裂解酶，可与嘧啶二聚体(如T-T dimer) 结合并分开之。 ——但哺乳动物等高等动物中无此酶 暗修复：切除修复_修复酶识别损伤部位并切除，以另一条链为模板进行 修补 重组修复_修复前可复制，但在受损部位留下缺口。重组酶使之 与完整的姊妹双链进行重组交换，以填补子链上的缺口。

  19. 第三节 DNA指导下的RNA合成(转录) 一、转录的概念 Transcription: synthesis of RNA guided by DNA. 二、原核细胞转录 (一)转录(与复制比较)的特点：合成方向均为53 比较转录复制 底物 NTP(A、G、C、U) dNTP(A、G、C、T) 酶 RNA聚合酶 DNA聚合酶 模板 模板DNA的1条链 模板DNA的2条链 引物 无(无核酸外切酶活性) 需要 核对作用 无(碱基错配率较高) 有 第1个产物 5pppA或5 pppG RNA引物，NTP (A、G、C、U)

  20. 第三节 DNA指导下的RNA合成(转录) 二、原核细胞转录 (二)RNA聚合酶组与功能 全酶：2识别转录起始 其中， 是起始因子，有启动子结合部位 2称为核心酶，起RNA合成的引发、链延长()及辨认转录终止()的作用

  21. 第三节 DNA指导下的RNA合成(转录) 二、原核细胞转录 (三)转录过程 1. 转录因子：参与RNA聚合酶进行转录活动的辅助因子，为蛋白质。 2.启动子：指RNA聚合酶的识别、结合和开始转录的一段DNA。 在RNA转录起点的上游，约40 bp。——TATA box 3.终止子：提供转录停止信号的DNA序列(片段)。 一般含有回文顺序，转录到此会形成发夹结构。 终止因子 ：有的终止子要因子的帮助才能终止RNA合成。 E. coli的因子以六聚体形式存在，具有DNA-RNA解螺旋酶和ATPase活性。

  22. 第三节 DNA指导下的RNA合成(转录) 二、原核细胞转录 (三)转录过程 转录过程： (RNA聚合酶全酶结合到启动子上)转录起始——> 转录第一个ATP或GTP， 亚基解离——> RNA链延长(转录鼓泡，含12 bp的DNA-RNA杂交螺旋)——> (遇到终止子)转录终止，释放聚合酶和RNA。 NB HybridAny applications?

  23. 模板链 合成方向 • (a)RNA聚合酶与DNA 模板链的结合 (b)转录起始 聚合酶 脱离 RNA释放 RNA链的延长 (c)RNA链的延长 (d)转录终止 Transcription

  24. 第三节 DNA指导下的RNA合成(转录) 三、真核生物mRNA合成 与原核生物RNA合成不同之处： • 转录产物有三种：mRNA、tRNA、rRNA 对-鹅膏蕈碱反应 • RNA聚合酶有三种： I 转录18S、5.8S、28S rRNA 不敏感 II 转录hnRNA (mRNA前体) 强烈抑制 III 转录tRNA、5S rRNA 高浓度时抑制 四、转录后加工 (略) 原核生物：mRNA不需加工 真核生物：三种RNA前体的转录后加工 (p284-285)

  25. 第四节 核酸生物合成的抑制剂 按照作用的对象、性质不同，分为3种： 一、模板功能的抑制剂 嵌合剂 如放线菌素D(p 288)嵌入dG-dC之间、EB为高灵敏度荧光试剂 烷化剂 二、RNA聚合酶的抑制剂 原核生物：利福平、曲张霉素 真核生物：-鹅膏蕈碱 三、核苷酸合成抑制剂(略)：aa-、叶酸-、碱基和核苷类似物 Any applications？

  26. 第五节 逆转录作用 Reverse transcription: RNA  DNA 以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成DNA。此时合成的DNA称cDNA (complementary DNA)。 逆转录酶是多功能酶： • RNA指导的DNA聚合酶活性 • DNA指导的DNA聚合酶活性 • 核糖核酸酶H活性 (属外切酶，水解模板链RNA) 与一般的转录不同之处在于： • 底物：dNTP cf NTP • 需要引物RNA cf 不需要引物

  27. 第六节 基因工程(略) • PCR—Polymerase Chain Reaction • DNA sequencing

  28. 第六节 基因工程--补充 1. RNA的复制——以RNA为模板合成RNA (略讲，p 286图10-20) (1963年从噬菌体中分离得到依赖于RNA的RNA聚合酶，需要专一的RNA模板，对其它的RNA不起作用。) 故，病毒繁殖有两种类型： RNARNA (replication) RNA DNA(reverse transcription)RNA(transcription) 2. 人工合成核酸——多核苷酸磷酸化酶(不需要模板) 将核苷二磷酸混合物或核苷二磷酸聚合成RNA nNDP————> (NMP)n + nPi Applications: Poly I、Poly C、Poly I: C

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