PËRMBAJTJA

1. PËRMBAJTJA • Zhvillimibioteknologjisëmolekulare • Metodat e studimittëqelizave • Teknika e veçimit me centrifugim • Kromatografia • Elektroforeza e proteinave • Përcaktimiipeshësmolekulare me anëtëelektroforezës • Elektroforeza e acidevenukleike • Detektimi ADN-së • Hibridizimiiacidevenukleike

2. Zhvillimibioteknologjisëmolekulare • m.odheqelizateukariotesi “fabrikabiologjike” përprodhimin e lëndëvetëtillasiinsulina, interferoni, horminirritjes, antigjenetvilare, dhenjësërëproteinash • Bimëtdhekafshëtjanëshndërruarnëbioreaktorënatyralëqëprodhojnëproteinangagjenetërejaosetëndryshuara • Vënia e teknologjivetërejagjenetike-molekularenëshërbimtëbioteknologjisë, çoinëlindjen e njëdrejtimitërirqquajturBioteknologjiMolekulare

3. Disiplinatqëkontribuojnënëzhvillimin e bioteknologjisëmolekularedheklasatkryesoretëprodukteveqëjepaajo • Biologjiamolekularemikrobiologjiabiokimiagjenetikainxhineriagjenetike BIOTEKNOLGJIA MOLEKULARE USHQIM Medikamentvaksinadiagnostikeblegtorimjedis

4. Historiku i zhvillimittë BT molekulare • 1943 penicilinaprodhohetnëshkallëindustriale • 1944 Avery, McCarty vërtetuan se ADN-jaështëmaterialegjenetik • 1953 Watson dhe Crick përcaktuanstrukturën e ADN-së • 1966 Deshifrohetkodigjenetik • 1970 Izolohetenzima e parë e restriksionit • 1973 Boer dheKohenstabilizojnëteknolgjinë e ADN-sërikombinante • 1978 Genetechprodhon insulin e njeriutnëE.Coli

5. BT molekulare • 1981 – prodhohetsekuencatoriiparëautomatiki ADN-së • 1988 – publikohetmetoda e PCR • 1990 – në SHBA jepetlejapërpërdorimin e metodavetëterapisëgjenikenëqelizatsomatike • 1997 klonimii deles Doly • 2000 -2001 sekuencimiigjenomit human

6. Metodat e studimittëqelizave • Metodat e rejatëbiologjisëmolekularekanëndikuarnënjohjen e ndërtimit, funksionitdhetëmekanizmaverregulluesqelizorë Konsistonnw : • Vecimin e pjesëvetëndryshmeqelizore • Teknikat: centrifugimi, kromatografia, elektroforeza

7. Teknika e vecimit me centrifugim • Fillimishtsuspensioniqelizortrajtohetmekanikisht, bluhet, formohetekstraktqelizor • Ekstraktiqelizor, nënshtrohetcentrifugimit, fillimisht me numërtëvogëlrrotullimesh • Meretnjë sediment kryesishtngambetjetërënda, ndërsapjesa e lëngëtsupernatantipërmbanfragmentemëtëlehtamebrana, ribozomeetj. • Supernatanticentrifuhoehetmëtejpërtëvecuarpërbërësit e tjerë, me anëtëultracentrifugave, shpejtësishumë e lartëdhenëtë temp. tëcaktuaraftohes +4 Gradë, qënuklejondëmtimin e pjesëveqelizore, nganxehtësia e prodhuar.

8. Teknika e vecimit me centrifugim

10. Metoda e studimitdhekarakterizimittëproteinave • Teknika e ndarjes: Ultracentrifugimittënjëpërzierjeproteinash (ADN) nënjë gradient saharoze, kupërqëndrimitij (saharozws) ështëmëiulëtnëanën e grykëssëepruvetësdhemë i lartënëanën e fundittëepruvetës. • Me anëtëcentrifugimittëpërzierjesproteinikepërnjëkohëtëgjatënënjë gradient tëtillëproteinatzhvendosenmigrojnënëmasëtëndryshmesipaspeshëssëtyre; atondalennëatënivelkudensitetiityrepërputhet me densitetin e saharozësnëtënjëjtinnivel. • Formohenshtresa (unaza) në tub dhemundtëvecohen me anëtëkullimit.

11. Metoda e studimitdhekarakterizimittëproteinave

12. Metodakromatografike • Ndarja e lendeve me metodekromatografikebazohetnwndarjen e ndryshmetwlendeve midis dyfazavetwsistemit : fazwstwpalevishme (stacionare) dhe fazes televizeshme (mobile) • Procesiindarjes se lendesbazohet ne njwngaparimetfizikale: adsorbim, ndarjabazuar ne madhesoine e molekulave, sidhekembimitjonik

13. kromatografia • Teknikëpërndarjen e proteinavenganjëekstraktqelizor • Kromatografianëkollonëështëmë e përdorshmjapërfitiminnëgjendjetëpastërtëproteinave. • Aparatikromatografikpërbëhetnganjëkollonëqelqiqëmbushet me njëlëndëtëngurtëtëpërshkueshme, me molekula me përmasatëndryshme, e zhyturnënjëtretëstëcaktuar • Ngaana e sipërmeshtohetpërzierjaqëduhettëndahet , dhekalonpërmesmatriksitqëmbushkollonën. • Parimiindarjessëproteinaveështëndryshëm; atomundtëndahennëbazëtë;përmasëssëtyre, tëngarkesëselektrike, oselidhennëmënyrëspecifike me lëndë “kapëse” qëndodhennëmatriksin e kollonës

14. kromatografia • Kjo e funditquhetkromatografia me afinitetdhepërkëtëzakonishtpërdorenenzimaspecifikepërproteinënqëkërokohettëvecohet. • Nënjë hap tëdytë me anëtëtretësveosetëlëndëvespecifikebëhetndarjaoseshkëputja e enzimavengaproteina. • figura

16. Elektroforeza e proteinave • ështënjëtjetërmetodëpërndarjen e fraksioneveqelizoresidomostëproteinavedheacidevenukleike • molekulatmigrojnënënjëfushëelektrikesipasngarkesëssëtyre, përmasavedheformës • Përpërcaktimin e peshësmolekulare, proteinafillimishtdenatyrohet me njedetergjentdhemë pas inështrohetelektroforezës. • Proteinatlëvizinnënfushënelektriketëdrejtuarangapërmasat • Duke maturmasën e levizjessënjëproteineapotënjëpërzierjeproteinashnëraport me njëproteinëstandarte me parmasatënjohura

17. Përcaktimiipeshësmolekulare me anëtëelektroforezës

18. Proteinišećernerepe􀀅 A - razdvojeni SDS-PAG elektroforezom, B -2D elektroforezom (M. Krsnik-Rasol􀀂􀀆􀀂D.Pavoković)

19. Përcaktimiipeshësmolekulare me anëtëelektroforezës • Ku ngarkohen (loading) proteinat e denatyrura ? Nëzhelpoliakrilamidosenë agar • Pas elektroforezëszhelingjyroset me ngjyruesspecifikpërproteinatqëbëntëmundurvizualizimin e bandavetëproteinavetëndara,kështupërcaktohetmasamolekulare e tyre (shikofigurenlartë). • Proteinatmundtëndahenedhevarësitëngarkesëssëtyreelektrike, kjongarkesëshprehet me anëtëpikëssëtyreizoelektriked.m.th vlera e pH kuproteinatnukkanëngarkesëelektrike

20. Përcaktimiipeshësmolekulare me anëtëelektroforezës • Teknikaquhet: teknika e fokusimitizoelektrik, kuproteinatlëvizinnënjë gradient pH, d.m.th cdoproteinëlëvizdhendaletnëzhelnëpikënkuvlera e pH përputhet me atëizoelektriketëproteinës (pranë pH kunuk ka ngarkesëelektrike) Me këtëelektroforezëmundësohetndarja e përzierjeveqëpërmbajnëderinëqindraosemijëraproteinatëndryshme, p.sh ekstarktetqelizore

21. ZHEL ELEKTROFOREZA ME AGAROZё Çfar pёrfaqёson elektroforeza? • Zhelelektroforeza me agarozёёshtёmetoda qёshfrytёzohet nёbiokimidhebiologjinёmolekulare pёr tёfraksionuarmolekulat e ADN, ARN-sёsipasmadhёsisё sёtyre nёçb (çiftebazashnga 20-30 kb). Kjorealizohet duke migruarmolekulat e ngarkuaranegativisht tёacidevenukleike pёrmesnjёmatriksiagaroze nёn veprimin e fushёs elektrike (electrophoresis). Fragmentet e shkurtёra lёvizin mёshpejtdhemigrojnё mёgjatё se fragmentetgjata. Sambrook J, Russel Dё (2001)

22. Nxjerrjadhefitimi ne gjendjetepasterte ADN-se • Metodat e studimittëacidevenukleike • Ekstarktimi I ADN-së • Trajtimi e qelizave me enzima (proteinaza K), qëtretmembrabatqelizore, dhe me ARN-azë • MetodaFenol-kloroform • Ekstraktohet ne fund me etanol 96% • Në fund centrifugohet, 16000 rot/25 min, fundrinapra ADN-jatretet me tris EDTA ose me H2O tedistiliuar

23. Nxjerrjadhefitiminwgjendjetwpastwrtw ADN-sw

24. Detektimi ADN-së • Spektrofotometria- veti e ADN-sëpërtëthithurrrezatimin UV nëgjatësinë 260 nm, kjothithje I dedikohetbazavepurindhepirimidine • Zinxhiri I dyfishtë ka absorbancëmëtëulët se zinxhiri I njëfishtë • Centrifugimi I AND-sënë gradient tëCsCl,

25. Centrifugimi I AND-sënë gradient tëCsCl, • Molekulat e AND-sëkanëdensitettëndryshëm, • Ciftet G-C nëraport me ato A-T kanënjëdensitetmëtëlartë se A-T • Kydensitetimolekulavetë AND-sëmundtëpërcaktohet me anëtëcentrifugimittësajnëshpejtësishumëtëlartanënjë gradient tëCsCl • Solucioni I ADN-sështresëzohetmbinjësoluciontëCsCl, dhecentrifugohetnënjëshpejtësitëlartëderisatëarrihetgjendja e ekuilibrit • CsClformonnjë gradient nërritjengafilimiderinë fund tëepruvetës, ndërkohë mol. E AND-sëpozicionohenndakennëatëtëpërqëndrimittëCsClqëpërputhet me densitetin e tyre

26. Centrifugimi I AND-sënë gradient tëCsCl, • Kurmolekulat e ADN-sëkanëdensitettëndryshëm, nëekuilibër do tëmerennjësërëbandashtë ADN-së, kumë e rëndamigronmëshumëndërsa me e lehamëpak • Më pas nësolucionshtohetBrEtidiumidhebandate ADN-sëbëhentëdukshme me shtresaflouroshente, kurepruvetashihetnënrreze UV. • Me anëtëthithjes, bandatmundtëtërhiqennëformëtëvecuaranganjëratjetra

27. Elektroforezanwzhel e AND-swSi duketsistemielektroforezёs

28. Elektroforezanëzhel e ADN-së • elektroforeza

29. ZHEL ELEKTROFOREZA ME AGAROZё • kualitetin e ADN-sё sёizoluarngaindettumoraledhejotumoraledetektohet me anё tёzhelelektroforezёsagarozёzakonisht me pёrqёndrim 2% .

30. Detektimii ADN-së me anëtëfluoreshencës • AND-jakurtrajtohet me ngjyruesfluoroshent , vërehetfalëfluoroshencëssëkëtyrengjyruesvespecifike • Bromuriietidiumit, kancerogjen, nderfutet ne strukturën e ADN-së • Nëseshikohetnën UV rreze, bandat (shiritat) e sajabehentedukshme • figura

31. Standarti Osemarkeri

32. Radioaktivizimiiacidevenukleike • Radioaktivitetipërdoretshumënëfushënkërkimoretëacidevenukleike • Acidetnukleiketëradioaktivizuaramundtëdetektohen me anëtëautoradiografisë • Rrugëtpqrshëniminradioaktivtëacidevenukleike: • Ndërfutja e fosfatitradioaktiv, gjatëkryerjessësintezëssëacidevenukleike (sintetizohenzinxhirëradioaktive) P32 • shtimi I ATP-sëradioaktivenë fund të AND-së, mëanëtëenzimëspolinukleotid-kinaza, kufosfati I trete I ATP, transferohetnëgrupin OH tëskajit 5’ të mol, së AND-së • Shënimiqëndror me anëtësintetizimitin vitronëpranitënukleotideveradioaktive

33. Efekti I temp. mbiacidetnukleike • Me nxehjeprishenlidhejthidrogjenore • Ngrohja con nëdenatyrim I ADN-së • Sa mëfortëmbahenvargjet me njëritjetrinaqmë e fortëduhettëjetëtepm. e denatyrimit • Nëkëtëvetindikonpërmabjtja relative A-T / G-C, duke diturqëciftet A-T kanëdylidhjehidrogjenore, dhe G-C trelidhjetëtilla. • Prishja e vargjevetë ADN-sëmundtëndiqet me anëtëndryshimittëabsorbancëssësaj, (spektro) • Me rritjen e temp, absorbanca ka ulje, maximumi I absorbancëskurvargjetjanëndarëplotëshit • Me uljen e Temp, ADN-jafillotërinatyrohet

34. Hibridizimiiacidevenukleike • Hibridizimii ADN-së, ndërimi I vargjevetëdyfishtanganjëzinxhirëprimar • Rinatyrimi I AND-së • Mundtëformohencifte ADN_-AND, ARN-ARN • Teknikëpërnjohjen e gjeneve • Bëntëmundurkapjenapoidentifikimin e njefragmentitëinteresit • Kapjabëhet me anëtefragementeveqë u njihetradhitja SONDA, • Sondatradioaktive, • Hibridizimimundtëbehetedhepoasnjëelektroforeze ne zhel

35. fund • fund