第 14 章高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

第14章高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

14.1 概述 14.2 HPLC仪器包括：高压输液装置；进样系统；分离系统；检测系统；辅助系统。 14.3 流动相和固定相简介 14.4 高效液相色谱方法各论分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱

14.1 概述 高效液相色谱是以液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同分为：液液分配色谱；液固吸附色谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。

早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。

1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器 —10-11g。

2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。

极性增加 不溶于水溶于水非极性离子非离子极性分配吸附反相分配正相分配离子交换分子量尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤 3. 应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象

14.2 HPLC仪器 • HPLC仪器包括： • 高压输液装置; • 进样系统; • 分离系统; • 检测系统; • 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 • 其工作过程如图所示。

He 出口检查脉流消除高压泵入口检查储液瓶抽气分布器过滤 2m 到检测器分离柱反压调节过滤器压力计注样阀 HPLC仪器详解

1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。

恒压泵可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒压泵可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流泵可使溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。

到色谱柱 脉动阻尼器密封马达球阀往复式拉动溶剂机械往复柱塞泵示意图 4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。

六通阀 2. 进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。

3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。

接色谱柱 石英窗 UV 光电倍增管废液 4. 检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。 1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm, 体积约为1~10 L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。

皮质酮 氟美松可的松波长快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图

平面镜 样品遮光板透镜光源放大器光电转换记录仪参比光学零调零 2）荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。 3）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。

接色谱柱 接参比电极和对电极塑料块 Teflon 1 cm 工作电极 (Pt, Au, 碳糊) 4）安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成。如图。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。

5）电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射)、极谱等。

14.3 HPLC流动相和固定相简介 一、流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。理想的溶剂应有下列特性： 1）对待测物具一定极性和选择性； 2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么？) ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别； 3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时使截止波长增加； 4）化学稳定性好； 5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。

二、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱；硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为 3.5×108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。 2. 按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。

14.4 高效液相色谱方法各论 一、分配色谱 • 原理：根据各待测物在互不相溶的两溶剂中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。 2. 流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。

3. 固定相 原则上用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEG)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。 1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。

2）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）： Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。 Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。

3）. 正相和反相键合色谱法 在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？答：都是为防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。何为正相色谱，何为反相色谱？

正、反相色谱中极性和保留时间的关系 正相色谱反相色谱低极性流动相高极性流动相时间时间中等极性流动相中等极性流动相时间时间待测物极性：A>B>C

固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18 时间，min 硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。

二、离子交换色谱 将离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。 1. 原理：利用不同离子对固定相的亲和能力（离子交换能力）的差别实现分离。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离离子发生可逆交换反应：

对阳离子，滞留顺序为： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根, SO42-, C2O42-, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？

2. 固定相 按离子交换剂类型分四种：按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。

1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。微孔微孔 2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m);多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。微孔型大孔型离子交换剂硅胶层涂覆离子交换层惰性核惰性核薄膜型表面多孔型 3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子

3. 流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。 pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。

离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保留值减小。加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保留值减小。加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换： RM-L+X RM-X+L 该法用于分离各种氨基酸或碱类。思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？

三、离子色谱 离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。

例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应： R+—OH + HCl(流动相)——R+—Cl- + H2O R+—OH + MCl(待测物) ——R+—Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？

四、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。 1. 原理：将与待测物离子A、电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+：

由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3……..因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3……..因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？

五、尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱又称凝胶(渗透)色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。

2. 固定相 3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度)。

六、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：选择性过滤、纯化效果好。

七、色谱分离方法的选择

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