CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA ( HPLC )

1. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

2. Cromatografía líquida de alta eficiencia • La fase móvil es líquida • Partición o reparto • Adsorción • Intercambio iónico • Exclusión molecular

3. Cromatografía líquida de alta eficiencia • Características y ventajas • Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 mm) • Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7) • Rápida • Picos angostos (alta eficiencia) • Separa compuestos no-volátiles o térmicamente inestables

4. Esquema del equipo de HPLC INYECTOR PRE-COLUMNA BOMBA CÁMARA DE MEZCLA COLUMNA DETECTOR

5. Elución con gradiente Elución isocrática Elución isocrática vs elución con gradiente Elución isocrática: solvente de composición constante. Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía la composición de la FM en forma continua o escalonada.

6. Solventes utilizados como FM • Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras • Alta pureza • Desgasificados • Tratamiento con He • Sistema de desgasificación al vacío • Filtración

7. Sistemas de bombeo • Requerimientos • Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi) • Flujo libre de pulsaciones • Caudales 0.1 – 10 mL/min • Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)

8. Bomba recíproca o de movimiento alternado etapa de aspiración etapa de descarga hacia la columna pistón fase móvil Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a 10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del solvente Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

9. muestra eluyente eluyente columna columna Sistemas de inyección de muestra Llenado del bucle Inyección de muestra en columna

10. Sistemas de inyección de muestra

11. Sistemas de inyección de muestra

12. Precolumna • Composición similar a la columna cromatográfica • Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE • Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.

13. Columna • Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente • Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i. • Tamaño partículas de relleno: 5–10 mm • Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma

14. Columna

15. Columna Rellenos Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 mm de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero. Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 mm de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie.

16. Detectores • Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad) • Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite) • Requisitos • Sensibilidad adecuada • Respuesta lineal amplia • Respuesta rápida y reproducible • Manejo sencillo

17. Celda del detector UV-visible en HPLC De la columna Ventanas de cuarzo Fuente UV Detector Al desecho

18. Eficiencia de la columna Tamaño partículas de empaque Ensanchamiento extracolumna Tamaño de muestra

19. H vs m para partículas de diferentes diámetros 10 mm H 5 mm 3 mm m(cm/min)

20. H mg muestra/ g empaque Tamaño de muestra adsorción L-L (k = 2.3) De acuerdo al tipo de FE el efecto es más o menos pronunciado fase ligada (k = 4.3) fase ligada (k = 1.2)

21. pr2m Hex = 24 DM Ensanchamiento extracolumna Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatográfico (puerto de inyección y columna, columna y detector, etc.) radio del tubo [cm] velocidad lineal de FM [cm/s] coeficiente de difusión del soluto en fase móvil [cm2/s]

22. CROMATOGRAFÍA GASEOSA

23. partición G-L FM FE MÉTODO INTERACCIÓN adsorción G-L y G-FL G-S Cromatografía gaseosa líquida Gaseosa sólida

24. Ventajas: Alta resolución Alta velocidad Alta sensibilidad Separación de compuestos con PE ~ Limitaciones: Muestras volátiles o fácilmente vaporizables Deficiente para compuestos iónicos o de PM > 600 Deficiente como técnica cualitativa y preparativa Cromatografía gaseosa

25. Cromatógrafo de gases

26. Esquema de un cromatógrafo de gases cromatografía de elución sitio de referencia medidor flujo Detector puerto de inyección registro columna gas portador

27. Puerto de inyección septo de goma salida de purga del septo entrada gas portador salida de excedente Bloque de metal calentado cámara de vaporización vidrio columna

28. Columnas Columnas rellenas Columnas tubulares abiertas (capilares)

29. Columnas Columnas tubulares abiertas (capilares) Diámetro interno (100 a 700 mm) flujo poliimida Sílice fundida Soporte recubierto con FE líquida FSOT WCOT SCOT

30. FSOT WCOT SCOT Rellena Columnas

31. Fases estacionariasNombre comercial Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30 Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52 Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17 Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210 Polietilenglicol Carbowax 20M Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275 Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas en cromatografía de gases

32. Compuesto PE (°C) 1 acetona 56 2 pentano 36 3 propanol 97 4 metil etil cetona 80 5 6 7 8 9 10 hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano 69 117 102 98 138 126 CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad FE no-polarpoli(dimetilsiloxano) Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus puntos de ebullición. El determinante principal de la retención en esta columna es la volatilidad de los compuestos

33. Compuesto PE (°C) 1 acetona 56 2 pentano 36 3 propanol 97 4 metil etil cetona 80 5 6 7 8 9 10 hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano 69 117 102 98 138 126 CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad FE polarpoli(etilenglicol) alcanos cetonas pentanol propanol butanol La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE.

34. Isotérmica a 45 °C Isotérmica a 145 °C Programada Efecto de la temperatura en el cromatograma

35. Detector de conductividad térmica

36. electrodo colector llama aire H2 terminal de la columna gas portador Detector de ionización de llama (FID)

37. aislante al desecho de la columna emisor radiactivo b (Ni63, Sr90) + electrodo - electrodo Detector de captura electrónica

39. Uso de patrones externo e interno Uso de patrón externo S S P Área S Área S Área P Área Sx Área P [S] Sx [S]/[P] P Análisis cuantitativo en CL y CG Área Sx Sx

40. CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es un potente detector para análisis cualitativo y cuantitativo La espectrometría de masas es una técnica basada en ionizar moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas Un espectro de masas es un gráfico que muestra la abundancia relativa de cada fragmento que llega al detector de un espectrómetro de masas