Przechowywanie szczepów

1. Przechowywanie szczepów w warunkach domowych www.warzymypiwo.pl

2. Zawartość szkolenia • Trochę teorii o drożdżach • Potrzebne akcesoria- przechowywanie drożdży w laboratorium i w domu • Co to jest agar? • Co to jest żelatyna? • Procedura przygotowania podłoża • Procedura posiewu • Namnażanie szczepu do warki • Zakażenia • Gdzie kupić sprzęt?

3. Używane pojęcia • Szczep • Kolonia • Eza • Bakterie • Drożdzaki • Eukarionty • Prokarionty • Szafa laminarna • Pasaż • Posiew • pH • Żelatyna • Agar • Białka • Cukry • Tłuszcze • Mitoza • Mejoza • Posiew redukcyjny • Inkubacja Prośba! W przypadku wszelkich niejasności pytajcie!!!

4. Świat ożywiony

5. Drożdże (Saccharomyces sp.) • Fermentacja spontaniczna (Belgijski Lambic) • Lactobacillus sp. • Pseudomonas sp. • Candida sp. • Klockera sp. • Hansenula sp. • Pichia sp. • Fermentacja górna (Brytyjskie Ale) • Saccharomyces cerevisiae • Fermentacja dolna (Pilsner, Lager) • Saccharomyces pastorianus

6. Drożdże- morfologia

7. Drożdże- cykl komórkowy Mitoza: 71 minut G1 + S + G2: 54 minuty Cykl komórkowy: 125 minut Schemat cyklu komórkowego. M- mitoza (podział), G1, G2, S- interfaza, Go- faza spoczynku

8. Drożdże browarnicze- formy przechowywania • Drożdże płynne (Wyeast Labs) • Drożdze suche (Fermentis) • Szczepy na skosach (kolekcja szczepów)

9. Co potrzebujemy do utrzymania kolekcji szczepów w laboratorium? • Lodówka (koniecznie powyżej zera!), 5-15oC • Probówki (najlepiej zakręcane) • Podłoże (oparte na agarze) • Ezy 10 ul (platynowy drucik lub lepiej plastikowe sterylne) • Szafa laminarna • Palnik do opalania ezy i probówek • Alkohol etylowy 70%

10. Co to jest agar? • Agar- substancja żelująca, której głównym składnikiem są polimery cukru galaktozy: agaroza i agaropektyna. Agar-agar dobrze rozpuszcza się w wodzie o temperaturze ok. 85-90 °C, a zestala się, tworząc rodzaj żelu w 32-40 °C. Zestalony żel rozpuszcza się po ponownym podgrzaniu do 85-90 °C (histereza agaru). Agar wytwarzany jest z krasnorostów (Rhodophyta), wydobywanych głównie u wybrzeży Japonii, głównie z rodzaju Gelidium. Jest mieszaniną silnie żelującej agarozy (70%) i dającej lepkie roztwory agaropektyny (30%). Agar poligalaktozydem, w którym 90% galaktozy występuje w formie D (naturalna), a 10% w formie L (nie trawiona) • Na czym polega fenomen agaru? Agaroza i agaropektyna to policukry, które nie są trawione przez praktycznie żadne organizmy na ziemi • Stężenie agaru w pożywkach to 10-15 g/l

11. Podłoża bakteryjne i grzybowe • Podłoże grzybowe Sabouraud • Typowy skład (g/litr): pepton z kazeiny 5,0, pepton mięsny 5,0, D-glukoza 40,0, agar 15,0 • Przygotowanie: Rozpuścić 65 g/litr, autoklawować 15 min 121oC), nie przegrzać, pH 5,6+/- 0,2 w 25oC • Podłoże bakteryjne TSA • Typowy skład (g/litr): pepton z kazeiny 15,0; pepton z soi 5,0; chlorek sodu 5,0; agar 15,0 • Przygotowanie: Rozpuścić 40 g/litr, autoklawować 15 min, 121 °C, pH: 7,3 ± 0,2 w 25 °C • Podłoże grzybowe ekstrakt słodowy z agarem • Typowy skład (g/litr): Ekstrakt słodowy 100,0, agar 15,0, • Przygotowanie: Rozpuścić 115 g/litr, autoklawować 15 min 121oC, nie przegrzać, pH 6,0-6,2 +/- 0,2 w 25oC • Wniosek: bakterie rosną w pH zasadowym, a drożdże w kwaśnym

12. Co to jest pH? • Skala pH – ilościowa skala kwasowości i zasadowościroztworów wodnych związków chemicznych. Skala ta jest oparta na aktywnościjonów hydroniowych [H3O+] w roztworach wodnych. • Tradycyjnie pH definiuje się jako: pH = -log10[H3O+] • czyli ujemny logarytm dziesiętny aktywności jonów hydroniowych wyrażonych w molach na decymetr sześcienny. • Aby zrozumieć sens tej skali trzeba się najpierw przyjrzeć temu, co dzieje się w chemicznie czystej wodzie. Cząsteczki wody (H2O) ulegają samorzutnej autodysocjacji, co prowadzi do powstawania jonów H3O+ i OH- 2H2O ⇌ H3O+ + OH- • Reakcja ta jest odwracalna i ma równowagę przesuniętą silnie w lewo, czyli w stronę wody niezdysocjowanej. Stężenie jonów H3O+ w czystej wodzie w temp. 25°C wynosi 10-7 mol/l, a jej pH = -log(10-7) = 7. Ponieważ w czystej wodzie stężenie jonów wodorowych i wodorotlenowych jest takie samo, woda (czysta) ma odczyn obojętny (pH wynosi 7). W roztworach o pH < 7 stężenie jonów wodorowych jest większe niż wodorotlenowych i roztwory takie mają odczyn kwasowy, natomiast w roztworach o pH > 7 większe jest stężenie jonów wodorotlenowych, więc roztwory takie mają odczyn zasadowy.

13. Co potrzebujemy do utrzymania kolekcji szczepów w domu? • Słoiczki zakręcane (wąskie, najlepiej po oliwkach) • Podłoże (oparte na agarze lub żelatynie) • Ezy (drucik miedziany lub z żelaza- rozprostowany spinacz) • Palnik z kuchenki gazowej do opalania brzegów probówek (opcja) • Alkohol etylowy 96% • Lodówka (koniecznie powyżej zera!), 5-15oC

14. Podłoża do przechowywania grzybów- oparte na żelatynie • Żelatyna (gelatin) – naturalna substancja białkowa pozyskiwana z kości i chrząstek zwierzęcych (kolagen). 98-99% suchej masy żelatyny to białka. Zawiera bardzo dużą ilość aminokwasów cyklicznych proliny i hydroksyproliny. Rozpuszczona w wodzie tworzy układ koloidalny – zolliofilowy, który łatwo przechodzi w żel, o ile temperatura otoczenia nie jest zbyt wysoka. Topi się w 35oC, zestala się w 25oC, pH 5,5-5,7 • Stężenie żelatyny w pożywkach to 30-50 g/l • Podłoże grzybowe ekstrakt słodowy z żelatyną • Typowy skład (g/litr): Ekstrakt słodowy 100,0, żelatyna 30,0, • Przygotowanie: Rozpuścić 130 g/litr, autoklawować 15 min 121oC, nie przegrzać, pH 5,6+/- 0,2 w 25oC

15. Porównanie agaru i żelatyny

16. Procedura przygotowania podłoża- 100 ml • Odważ 3 g żelatyny lub 1,5 g agaru, wrzuć do garnka lub słoika • Odważ 10 g ekstarktu słodowego, wrzuć do garnka • Zalej 100 ml wody (może być gotująca) • Zagotuj podłoże w garnku i delikatnie gotuj dalej aż do rozpuszczenia agaru/ żelatyny lub też włóż słoik do łaźni wodnej i gotuj aż do rozpuszczenia agaru/ żelatyny • Wlej do probówek/ słoiczków do 1/3 wysokości • Nałóż zakrętki, ale nie zakręcaj!!! Zakręcenie spowoduje eksplozję! • Umieść probówki/ słoiczki w łaźni wodnej i gotuj przez 15 minut • Ułóż na pochylni i zaczekaj do zastygnięcia • Opcja- można pozostawić na 24 h i zagotować ponownie • Dokręć zakrętki (dopiero po wystygnięciu do temperatury otoczenia) • Uwaga! Podłoże jest gotowe do zaszczepienia po 24h (musi być ustabilizowane) • Uwaga! Podłoże nie może być przechowywanie na słońcu ze względu na przyspieszone procesy starzenia i powstawanie wolnych rodników • Podłoża ogólnonamnażające (o takich tu mówimy) nadają się do zaszczepienia przez około 3 miesiące

17. Jakość podłoży mikrobiologicznych • Sterylność- należy przetrzymać gotowe skosy przez 3-5 dni w temperaturze pokojowej. Jeżeli nie widać zmian n podłożu ani żadnego wzrostu to podłoże jest sterylne • Żyzność- parametr opisujący zdolność podłoża do podtrzymywania wzrostu. Dla podłoży wybiórczych może mieć wartość nawet 30% (na 100 posianych komórek wyrasta 30) • Stabilność- spadek żyzności wraz z czasem przechowywania. Spadek do 70% uważany jest za nieszkodliwy. Poniżej 70% wartości wyjściowej podłoże nie nadaje się do posiewu szczepów. Dla podłoży ogólnonamnażających spadek 70% następuje po około 5-6 miesiącach składowania szczepu

18. Ożywianie szczepów • Uwaga! Przed odkręceniem zakretki probówka/ słoik musi być wyciągnięta z lodówki i doprowadzona do temperatury otoczenia! Jest to 15-20 minut w 20-25oC • W przeciwnym wypadku (zimna probówka) na wewnętrznych ściankach probówki skropli się woda i osiądą cząsteczki zawieszone w powietrzu wraz z bakteriami • Pewne zakażenie szczepu!

19. Technika pracy przy posiewie- laboratorium

20. Technika pracy przy posiewie- warunki domowe • Sterylizacja ezy 96% spirytusem • Zamoczyć ezę w spirytusie na kilka- kilkanaście sekund • Wytrzeć ezę w ręcznik papierowy nasączony spirytusem • Poczekać kilka sekund do ulotnienia się spirytusu • Przesiać szczep (pobrać ezą z jednej probówki i przenieść do drugiej) • Umieścić probówki na dwa dni w temperaturze pokojowej 20-25 °C • Uwaga! Po jednym dniu inkubacji na chwilę odkręcić zakrętkę (poluzować do usłyszenia syknięcia) i natychmiast zakręcić ponownie • Po dwóch dniach umieścić w lodówce w temperaturze 5-15 °C • Przechowywać do pół roku

21. Idealny model kolekcji szczepów Skosy macierzyste Skosy robocze Namnażanie do warki Każdy skos maksymalnie 5 otwarć/ 5 pasaży (!) Przechowywanie na skosie do pół roku (!)

22. Namnożenie szczepu do warki • Należy stosować zasadę rozcieńczenia 1:10. Browary zaczynają od 5 ml. My spokojnie możemy zacząć od 50 ml i dojść do 500 ml (dwa etapy, a nie trzy). Namnażanie w warunkach maksymalnego dostępu tlenu, temperatura 20-25oC dla drożdży górnej i dolnej fermentacji! • Szczepy górnej fermentacji na 20l warkę- starter 1 l • Szczepy dolnej fermentacji na 20l warkę- starter 2 l • Uwaga! Po namnożeniu drożdży i ich opadnięciu na dno wylać zużytą pożywkę i użyć samych drożdży z dna!!! • Dobra fermentacja powinna zastartować po 10h od dodania drożdży! Słoik 100 ml, ale starter 50 ml. Trzeba zostawić miejsce na powietrze! Inkubować 2 dni. Wytrzasnąć 1x dziennie (natlenianie) Słoik 1000 ml, ale starter 500 ml. Trzeba zostawić miejsce na powietrze! Inkubować 3-4 dni. Wytrzasnąć 1x dziennie (natlenianie)

23. Zapobieganie zakażeniom kolekcji drożdży • Stosowanie pełnego modelu kolekcji szczepów (skosy macierzyste i robocze) • Stosowanie rękawiczek lateksowych • Stosowanie palnika do opalania brzegów probówki • Przestrzeganie zasady pięciu otwarć/ pięciu pasaży • Stosowanie właściwych podłoży (kwaśne pH) • Stosowanie zakręcanych probówek (ograniczenie dostępu tlenu) • Stosowanie dedykowanych ez do danego szczepu

24. Co robić w sytuacji zakażenia? Posiew redukcyjny do uzyskania pojedynczych kolonii. Czystą kolonię przesiać na szczep. Uwaga! Nie pomylić bakterii z drożdżami! Kolonie drożdży rosną wolniej (2-3 dni), są duże i kremowo-białe.

25. Gdzie to można kupić? Browamator • Agar-agar 10gSubstancja żelująca, surowiec niezbędny do przygotowania pożywki wykorzystywanej do przechowywania szczepów drożdży (skosy agarowe). Przygotowanie pożywki: rozpuścić 2 g agaru-agaru w 100 ml gorącej (ok. 95*C) niechmielonej brzeczki piwnej o ekstrakcie ok. 10*Blg. Następnie odmierzoną ilość pożywki rozlać do próbówek i przeprowadzić sterylizację. Opakowanie zawiera: 10 g agaru-agaru w formie proszku.Wysyłka do 7 dni 7 zł. 30 gr. • Szklana próbówka z zakrętką 160 x 16 mmSzklana próbówka z zakrętką, polecana do przechowywania i transportu drożdży. Wykonana z wysokiej jakości materiałów, może być sterylizowana w temp. do 120°C. Wymiary: - wysokość: 160 mm, - średnica: 16 mm.Wysyłka do do 7 dni 3 zł. 60 gr. • Muntons Spraymalt - Extra Light (Extra Jasny) - 500 gEkstrakt słodowy w proszku - wersja Extra Light - Extra Jasny. Oryginalny produkt Muntons PLC (Anglia).Zastosowanie: składnik brzeczki piwnej, polecany do jasnych piw w stylu amerykańskim oraz do jasnych lagerów (przy 20 litrach piwa uzyskanie 1°Blg wymaga użycia ok. 0, 25 kg ekstraktu w proszku), - surowiec do przygotowania startera drożdżowego (100 g na 1 litr startera), - surowiec do refermentacji (przeciętnie 200 g na 20 litrów piwa). Opakowanie zawiera 500 g ekstraktu słodowego w proszku. Kolor: max 8 EBC. Wilgotność: max 5%. Białko: max 7, 5%. pH: 5, 6. • Wysyłka do do 7 dni 14 zł. 90 gr.