Transg n se v g tale

1. Transg�n�se v�g�tale

2. Biotechnologie et plantes S�lection traditionnelle

3. Techniques traditionnelles pas si mauvaises mais �. longues

4. Introduction Cellule v�g�tale = totipotente In vitro = r�g�n�ration possible d�une plante enti�re � partir d�une cellule somatique Paroi pecto-cellulosique rigide = obstacle au transfert Deux types de technique: M�thode physique/chimique G�nie bact�rien (Agrobacterium) : spectre longtemps limit� aux dicotyl�dones

5. Le g�ne d�int�r�t Premi�re �tape = Rep�rage et choix d�un g�ne d�int�r�t Clonage par insertion dans un plasmide Transfromation de ce plasmide dans une bact�rie (g�n�ralement E. coli) Multiplication possible de la bact�rie Donc multiplication du plasmide (= amplification) d�o� obtention de nombreuses copies du g�ne d�o� manipulation possible = r�alisation de la construction g�n�tique pour le transfert et l�expression chez les cellules v�g�tales transg�niques

6. I- Transfert de g�nes chez les v�g�taux Succ�s = conjonction de P�n�tration ADN �tranger jusque dans les noyaux chez cellules v�g�tales Int�gration stable dans le g�nome de l�h�te et transmission aux cellules filles Aptitude des transg�nes � �tre exprim�s : n�cessit� de signaux de r�gulation de la transcription et de la traduction reconnaissable par machinerie cellule v�g�tale S�lection des cellules g�n�tiquement modifi�es = g�ne marqueur d�terminant un caract�re de r�sistance r�g�n�ration de plantes enti�res � partir des cellules OGM = ma�trise de la culture in vitro

7. I- Transfert de g�nes chez les v�g�taux Plusieurs alternatives : transfert direct transfert par transformation avec Agrobacterium tumefaciens La s�lection des cellules g�n�tiquement modifi�es: . petit nombre de cellules modifi�s sur le total des cellules soumises au transfert : n�cessit� d�une s�lection . g�ne marqueur de transfert (ex: g�ne de r�sistance aux ATB) . culture des cellules v�g�tales en pr�sence de l�ATB : cellules g�n�tiquement modifi�es = se multiplient autres cellules = meurent

8. I-A- Transfert direct de g�nes Si l�ADN transf�r� atteint le noyau : expression possible de l�ADN ? prot�ine �Expression transitoire� � la faveur de la r�plication de l�ADN nucl�aire = int�gration possible � l�ADN chromosomique �Int�gration stable� Pas de d�h�te vecteur Information g�n�tique � transf�rer = g�ne d�int�r�t clon�e dans un plasmide avec au minimum une origine et des fonctions de r�plication chez E. coli pour amplification du mat�riel marqueur de s�lection (r�sistance ATB) sur le m�me plasmide ou sur un second (co-transfert) Sous forme native circulaire ou lin�aris�e (enzyme de restriction)

9. I-A Transfert direct de g�nespar transformation de protoplaste Protoplaste = cellules v�g�tales isol�es d�barrass�es de leur paroi pectocellulosique par traitement enzymatique Int�r�ts : disparition paroi v�g�tale = disparition barri�re au transfert cellules isol�es = facilit� de r�g�n�ration � partir d�un unique protoplaste transform� et obtention d�une plante enti�rement transg�nique M�thode pour faire p�n�trer l�ADN: chimique :PEG = +++ = d�stabilisation membrane plasmique (1982) (Fig 1) �lectroporation: impulsions �lectriques br�ves et fortes = polarisation des phospholipides = pores = passage ADN (1985) (Fig 2) Physique : fusion entre protoplastes liposomes = v�sicules artificielles de phospholipides encapsulant l�ADN � transf�rer fusionnant (faible rendement de transfert) R�g�n�ration � partir de protolastes transg�niques (fig 3) Limites : uniquement sur v�g�taux cultivable in vitro et r�g�n�rable � partir d�un protoplaste Int�r�ts : +++ chez monocotyl�dones r�put�es insensibles � Agrobacterium. Ex : Riz, Ma�s, orge

13. I-A Transfert direct de g�nes par canon � particules ou bolistique Objectif : forcer le passage � travers la paroi pectocellulosique (1987) Cellules: m�rist�me, embryon, � Principe : . Projection de petites billes d�or ou de tungst�ne (0.6 � 1.6 mm) enrob�s d�ADN plasmidique (environ 1 mg par bombardement) sous vide . P�n�tration sans dommages irr�parables aux cellules v�g�tales . Solubilisation de l�ADN transform�e au contact de l�ADN chromosomique nucl�aire . Expression transitoire ou int�gration dans ADN chromosomique . D�veloppement de l�organe trait�e = plante mosa�que avec cellules de lign�e germinale transform�e certaines graines = embryon enti�rement transform� Int�r�ts: cellules non transformables par Agrobacterium (c�r�ales, l�gumineuses) Limites : co�t pr�paration des billes enrob�es expression transitoire: stabilit� = 0,1 � 1% des cellules car difficult� de p�n�tration difficult� de r�g�n�ration stress = mortalit� nombre de copies de transg�nes/cellules = mal maitris� (1 � 25) Conclusion: long et d�licat faisabilit� �prouv� soja, coton

17. Param�tres du tir particules (nature, forme, agglom�ration, dispersion Mode de pr�paration et enrobage de l�ADN: Circulaire ou lin�aire Pr�cipitation sur particule par ajout de spermidine et de chlorure de Calcium Taille jusqu�� 150 kb Conditions de culture des v�g�taux (T�, photop�riode, hygrom�trie) Tissus les plus aptes � la r�g�n�ration et � la s�lection des transformants Cellules en divisions actives = culture de cellules embyog�nes +++

18. Monocotyledones

20. Apr�s bombardement, les cals sont plac�s sur un milieu s�lectif contenant un herbicide pendant 3 semaines

23. Tableau 1 P59

24. I-A Autres techniques de transfert physique Electroporation des tissus et des cellules intactes: Co�t faible/mise au point difficile El�ctrophor�se : sch�ma Sonication Traitement de laser Micro-injection : sch�ma Synth�se (voir tableau)

27. Tableau 3 P65

28. I-B Transfert g�n�tique bact�rienLa galle du collet

29. La galle du collet

30. Plantes transg�niques et Agrobacterium Phytopathologistes Erwin SMITH: Galle du collet et Agrobacterium tumefaciens 1942 : d�veloppement anarchique des tissus v�g�taux � l�emplacement d�une blessure = nature tumorale 1960-1970 : INRA Versailles Tumeur = synth�se d�acides amin�s sp�cifiques appell�s �opines� Absente chez cellules saines octopine et nopaline d�rivent de l�arginine agropine d�rive du glutamate synth�se d�pendant de A. tumefaciens opines : catabolis�es par les bact�ries agissent comme facteurs de croissance

31. Agrobacterium tumefaciens Bact�rie du sol Bacille a�robie flagell� � coloration de Gram n�gative Famille des rhizobiac�es Toutes les plantes ne sont pas sensibles Tissus infect�s: Croissance ind�finie en l�absence de r�gulateur Synth�se d�une nouvelle classe de mol�cules de faible masse mol�culaire: les opines (nopalines, actopine, mannopine, agrocinopine) Pr�sence simultan�e de cellules v�g�tales transform�es et non transform�es

32. Origine des tumeurs: r�le du plamside Ti (tumor-inducing plasmide) - 1974 Possibilit� d�hoter leur pathog�nicit� aux souches d�A. tumefaciens Possibilit� pour les souches avirulentes de devenir virulentes au contact des souches virulentes Sugg�rait l�existence d�un �l�ment g�n�tique extra-chromosomique Pr�sence de larges plasmides chez A. tumefaciens Pr�sence corr�l�e � la virulence Plasmide Ti pour Tumor-inducing

33. Ti Plasmid Grand plasmide : 200-kb Plasmide conjugatif ~10% de l�information du plasmide sont transf�r�s apr�s infection par le plasmide = ADN-T Integration de ce ADN-T = au hasard dans l�ADN nucl�aire des cellules v�g�tales Plasmide Ti code: enzymes impliqu�es dans le m�tabolisme des opines prot�ines impliqu�es dans la mobilisation de l�AND-T (g�nes Vir)

34. Plasmide Ti

35. G�nes Vir (virulence) Situ�s sur le plamsides Ti Assure le transfert de l�AND-T chez la plante Activ�s par l�acetosyringone (AS) (flavono�des) lib�r� par une plaie sur le v�g�tal 7 groupes de g�nes : virA,B,C,D,E,F,G repr�sentant 30 kb sur le plamside Ti

36. Fonctions des g�nes Vir virA : assure le transport d�AS dans la bact�rie et une activation post-transcriptionelle de Vir G virG : assure l�initiation de la transcription des autres g�nes Vir virD2: endonuclease qui coupe l�AND-T aux extr�mit�s sur un simple brin 5� virE2 : prot�ine de liaison de l�ADN simple brin dans la cellule v�g�tale et adressage dans le noyau virB : 11 ORFs assurant le transfert des complexes AND-Prot�ine � travers les membranes cellulaires

40. Plasmide Ti

42. Expression de l�ADN-T chez la cellule v�g�tale Modification du m�tabolisme Modification de la sensibilit� � des substances de croissance d�o� responsable du ph�notype tumoral L�ADN-T de A. tumefaciens est excis� et int�gr� dans le g�nome v�g�tale selon un m�canisme naturel d�infection Tout fragment d�ADN situ� entre les bords L et R de l�ADN-T sera transf�r�

43. Agrobacterium rhizogenes Au site de blessure = syst�me racinaire ��chevelu�� (hairy-root)

44. Agrobacterium et plantes transg�niques Introduction de g�nes nouveaux dans des plantes Utilisation des particularit�s d�Agrobacterium Plasmide Ti = r�gions essentielles � la mobilisation et � l�int�gration d�ADN bact�rien chez la plante : S�quences r�p�t�es de 25 pb bordant l�ADN-T G�nes de virulence vir R�gions � d�l�ter: G�nes de synth�se d�auxine G�nes de synth�se des cytokinines On parle de plasmide ��Ti d�sarm�s�� Probl�me : Impossibilit� de cloner directement les g�nes d�int�r�t dans les plasmides d�veloppement de vecteurs particuliers s�quences � transf�rer plac�es dans un vecteur : ais�ment manipulable in vitro taille r�duite capable de se multiplier chez E. coli 2 types de strat�gie : syst�me � 2 vecteurs syst�me � vecteur co-int�gr�

46. Vecteur co-int�gr� Plamside Ti hybride

48. Vecteur co-int�gr� Plamside Ti hybride

51. Syst�me binaire de transformation

52. Syst�me binaire de transformation

53. Syst�me binaire de transformation

54. Vecteur binaire Strategie: Placer l�ADN-T sur un petit plasmide ind�pendant Enlever les g�nes aux et cyt (absence de tumorisation) Ins�rer un marqueur de s�lection (g�ne de r�sistance) sur l�ADN-T G�nes Vir plac�s sur un plasmide ind�pendant Placer les g�nes �trangers entre les extr�mit�s de l�ADN-T R�aliser une co-transformation d�Agrobacterium avec les deux plasmides Infecter la plante avec les bact�ries transform�e Apr�s s�lection et r�g�n�ration, r�cup�ration de plantes avec des g�nes pr�sents dans toutes les cellules : obtention d�un plant transg�nique

56. Vecteur bas� sur plamside Ti

58. II - R�g�n�ration in vitro des plantes transg�niques Agrobacterium tumefaciens

59. R�g�n�ration in vitro des plantes transg�niques Pour bon nombre d�esp�ces de plantes: possibilit� de r�g�n�rer une plante � partir d�une cellule isol�e Utilistaion d�hormone v�g�tales induisant une multiplication de scellules et leur diff�rencaition (racines, tiges, feuilles, �) Plantes ainsi r�g�n�r�es capables de se reproduire normalement Sur cellules transform�es = obtention d�une plante dont toutesles cellules portent le transg�ne qui se transmettra selon la loi de MenDEL comme les g�nes endog�nes

60. R�g�n�ration in vitro des plantes transg�niques Agrobacterium rhizogenes

61. Transformations in planta Imbibition des graines: Graines incub�es avec A. tumefaciens avec vecteur binaire r�sistant � la kanamycine 0.32% des graines Kanamycine R Transformation par infiltration Infloraiscence tremp�es dans solution d�Agrobacterium portant un vecteur binaire �..

65. Applications majoritaires En termes de surface cultiv�e avec transg�niques: R�sistance aux herbicides = 79% R�sistances aux insectes = 29% Autres applications < 1%

66. Applications majoritaires En termes de surface cultiv�e avec transg�niques:

67. Comparatif OGM/Traditionnel

69. Adaptation des plantes au milieu R�sistances aux pathog�nes Pertes = 37% de la production mondiale (1/3=insectes) Limitation de l�utilisation des pesticides = polluant R�sistances aux insectes: toxine de B. thuringiensis antiprot�ases v�g�tales

70. Cas d�une OGM g�n�rant un insecticide(g�nes de la bact�rie Bacillus thuringiensis)

73. P136

74. P136

75. USA : Bl� BT = 26% Int�r�ts/inconv�nients : Toute la plante est impr�gn� de l�insecticide Pas de main d�oeuvre Diminution de l�application d�insecticides (??) Pb de la s�lection d�insectes r�sistants Pression de s�lection forte des plantes Bt Pb de dynamique des populations Strat�gie des aires de refuges Strat�gies de double r�sistance

76. Enjeux ecologiques Toxicit� du pollen Bt pour les chenilles de papillon monarque en bordure de champs Bt mais risque pas plus important qu�avec insecticides Dispersion des g�nes de r�sistance aux antibiotiques mais existence de syst�me pour eciser les g�nes de R Pollinisation de vari�t�s dans les champs voisins car transport pollen par le vent pb pour le maintien de l�agriculture biologique Transfert horizontal vers des vari�t�s sauvages d�o� risque de pullulation de certaines esp�ces

78. Cas d�une OGM r�sistante � un herbicide (Glyphosate, ...)

82. Tol�rances aux virus Perte de 10% de perte Diff�rentes strat�gies Expression du g�ne de la prot�ine de capside Expression d�ARN satellite et d�ARN antisens Blocage des mouvements intercellulaires

88. Particularit�s des prot�ines recombinantes � usage biopharmaceutique produites par transg�n�se Pas de bior�acteurs : culture en plein champs Source de biomasse la plus accessible : feuilles (tabac, luzerne) . m�tabolisme actif et complexe = prot�ines complexes possibles . activit� prot�asique ++ = limite l�accumulation graines (colza, soja, ma�s, riz, �) moins d�eau = prot�ines plus stables stockage sans d�gradation pendant plusieurs mois necessit� de floraison = risque de diss�mination ++ R�g�n�ration et propagation tr�s facile des cellules g�n�tiquement modifi�es (cellules de cals) Propagation par bouturage dans certains cas (luzerne)

89. Environnement

90. Sant�

91. Les industriels des biotechnologies

92. Les Brevets

93. Le Tiers Monde