Técnicas de conservación vegetal

1. Técnicas de conservación vegetal Técnicas moleculares aplicadas al estudio de la conservación vegetal Isabel Mateu Andrés

2. Introducción La variabilidad genética es la que permite actuar a la selección natural  materia prima de procesos evolutivos. La variabilidad genética permite a los organismos adaptarse a diferentes condiciones ambientales  debe conservarse para mantener la especie. Conocer la diversidad genética y como se reparte dentro y entre poblaciones es básico para diseñar programas de conservación. No hay relación directa entre variabilidad genética y nivel de riesgo. Debe considerarse a nivel de especie y comparando con especies próximas (Gitzendanner & Soltis, 2000).

3. Aspectos relevantes en la utilización demarcadores moleculares – La mayoría de los marcadores moleculares representan variabilidad en regiones no-codificantes del ADN. Su variación es neutral desde el punto de vista de selección natural. – Distintos marcadores difieren en la cantidad de variabilidad que muestran. Es necesario ajustar el tipo de marcador a cada problema y su escala espacial. – Tipos de marcadores: Codominantes (patrones de banda distinguibles en homocigotos y en heterocigotos), Dominantes. – Herencia: ADN nuclear- biparental; ADN citoplásmico (mtDNA; cpDNA)-uniparental.

4. Características deseables Las características que debe reunir un buen marcador molecular son: • Que sea altamente polimórfico. • Que tenga carácter codominante, capaz de discriminar los diferentes alelos de un gen. • Que este distribuido a través del genoma  información más representativa. • Que no presente efecto pleiotrópico, es decir, que un gen no afecte a mas de una característica. • Que sea altamente reproducible. • Que sea de fácil y rápida ejecución y, si es posible, automatizable.

5. Marcadores moleculares Alozimas: Detección de variantes electroforéticas de enzimas en geles de almidón. Se caracterizan por su bajo nivel de polimorfismo comparadas con productos de ADN. RFLP: Se detectan variantes genotípicas como variaciones de tamaño de fragmentos de restricción. Minisatélites: Designa a loci con número variable de repeticiones de secuencias tandem (VNTR). El número de repeticiones es muy variable, generando polimorfismos. Los fingerprints son visualizaciones simultáneas de varios loci de un mismo individuo. Métodos basados en PCR: • Microsatélites • AFLP • RAPDs • Secuenciación de ADN

6. PCR(Polymerase Chain Reaction) Esta técnica, ideada en 1989 por Mullis, permite amplificar más de un millón de veces un ADN siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. En la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos complementarios a las zonas flanqueantes de la región a amplificar, que actúan como cebadores para la síntesis de ADN in vitro. La síntesis de ADN está catalizada por la Taq polimerasa, producida por una bacteria (Thermus aquaticus) capaz de crecer a temperaturas entre 79-85ºC A esta temperatura dicha enzima es capaz de realizar una media de extensión superior a 60 nucleótidos por segundo. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los cebadores y para la extensión, aumentando el nivel de exigencia de la reacción y reduciendo la extensión de los cebadores unidos inespecíficamente al ADN.

7. RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) Se usan decanucleótidos para amplificar áreas específicas distribuidas al azar en el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de anillamiento (36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA  son muy polimórficos. Los fragmentos se separan en geles de agarosa. Ventajas: Es cómoda, rápida, requiere poco DNA que, además, no necesita ser muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Inconvenientes: No da información sobre el número de copias que el DNA genómico contiene de la secuencia amplificada. Oligo OPA-11

8. AFLPs(Fragment Length Polymorphisms):POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS Se basa en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción de ADN genómico. La base molecular del polimorfismo de los AFLPs, son las diferencias en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción (generalmente EcoRI y Msel). Estos cambios se deben a mutaciones puntuales, inserciones, delecciones, o redistribuciones en el genoma debido a translocaciones e inversiones, lo cual causa la perdida o ganancia de secuencias de reconocimiento. Son marcadores dominantes pero altamente reproducibles.

9. La técnica comprende cuatro etapas: 1, Generación de fragmentos de restricción de DNA genómico. 2, Ligación de adaptadores específicos a los fragmentos. 3, Amplificación selectiva de un grupo de fragmentos vía PCR. 4, Separación de los fragmentos amplificados por electroforesis y análisis de los fragmentos amplificados.

10. Microsatélites (SSR): Secuencias simples repetitivas Son secuencias pequeñas de 1 a 4 nucleótidos que se repiten en bloque. En mamíferos las secuencias más comunes son (GT)n y (CA)n. En plantas, las secuencias mas comunes son (AA)n y (AT)n. Pueden ser amplificados vía PCR, utilizando un par de cebadores de 20-30 bases diseñados especificamente. La base molecular de polimorfismo radica en la diferencia del numero de unidades repetitivas en los diferentes loci de microsatélites . Cada segmento, de tamaño diferente representa un alelo distinto de un locus. Los segmentos amplificados son separados por electroforesis en geles de agarosa o mediante secuenciador. Ventajas: Su alto polimorfismo, que les hace altamente informativos. Son codominantes, lo que permite diferenciar individuos homocigotos y heterocigotos. Están más o menos dispersos a través del genoma. La técnica puede ser automatizada.

12. Prácticas • Extracción de ADN. • Amplificación de ADN mediante PCR. • Interpretación de productos de PCR: - Geles de agarosa. - Electroforesis capilar. Uso de Genescan y Genotyper. • Secuenciación de fragmentos. • Análisis e interpretación de datos. Manejo de software.

13. Estimadores de diversidad genética La diversidad genética puede cuantificarse a tres niveles: • A nivel de genes: P, proporción de loci polimórficos entre los analizados = P/N. Se pueden aplicar los criterios del 99% o 95%: Un locus es polimórfico si la frecuencia del alelo más común es igual o menor que 0.99 ó 0.95, respectivamente. • A nivel de alelos: A, Riqueza alélica o número medio de alelos por locus. • A nivel de poblaciones: Heterozigosis esperada suponiendo equilibrio de Hardy-Weinberg k H=1-Σpi2 siendo pi la frecuencia del alelo i de cada locus. Un test nos indicará i=1 si se encuentra o no en equilibrio. • Coeficiente de endogamia: FIS= 1- Ho/He, siendo Ho la heterozigosis observada y He la esperada. FIS=0 indican que la población está en equilibrio de Hardy-Weinberg, mientras que valores negativos indican exceso de heterozigotos y positivos defecto de ellos.

14. Distribución de la diversidad genética La diversidad genética de una especie se mide a través de coeficientes de variabilidad (H de Nei) o bien como su inversa, los coeficientes de endogamia (F de Wright). En todo caso se supone panmixia, es decir apareamiento entre individuos al azar. La variabilidad genética total de una especie se mide como: k HT=1-Σ pi2 (pi promediada entre poblaciones) i=1 En una población subdividida en poblaciones (sub)poblaciones, la diversidad genética total puede subdividirse en la diversidad presente dentro de cada población y entre poblaciones. El promedio de la diversidad intrapoblacional se conoce como HS La diversidad genética media entre poblaciones es Dst =HT–HS El coeficiente de diferenciación genética es la proporción de variación entre poblaciones respecto al total: FST = GST =DST/HT Estos valores varían entre 0-1. Valores de GST <0,15  escasa diferenciación entre poblaciones “ 0,15-0,25  poblaciones considerablemente diferenciadas “ >0,25  poblaciones fuertemente diferenciadas genéticamente

15. Estimas del flujo génico FST y GST son, también, una medida indirecta del flujo génico entre poblaciones, es decir, del número de gametos o individuos que se desplazan entre poblaciones. Valores bajos de diferenciación genética son consecuencia de un elevado flujo génico y a la inversa. FST = GST = 1/1+4Nem Ne = tamaño efectivo de la población m = tasa de migración Dado que, en muchas ocasiones, es imposible obtener una estima independiente de Ne se estima el factor Nm en conjunto como número efectivo de migrantes por generación: Nm= (1 - GST)/(4 GST) Valores de Nm >1 indican un flujo genético suficiente para impedir una diferenciación sustancial por deriva genética.

16. Aislamiento por distancia Para saber si existe o no aislamiento por distancia entre poblaciones, se aplica el Test de Mantel que obtiene la correlación entre dos matrices de distancias, una de distancia genética y otra de distancia geográfica. n Z =  XijYik ij Xij e Yij son los elementos no diagonales de las respectivas matrices Como resultado, se obtiene un valor de r que nos da la medida del ajuste, así como un valor de P que nos da la significación.

17. Alternativa, o complementariamente, al test de Mantel podemos representar gráficamente el agrupamiento de las poblaciones en un dendrograma obtenido a partir de una matriz de distancia genética entre poblaciones. Una representación gráfica nos permite visualizar el agrupamiento de poblaciones y ver si dichos grupos se corresponden o no con su situación geográfica.

18. Implicaciones en conservación • Nivel de riesgo genético de la especie y cada población. • Estima de la capacidad de restauración de poblaciones naturales en caso de extinción. • Prioridades en la conservación de especies. • Diseño de estrategias complementarias: - Conservación ex situ. - Refuerzos poblacionales.