SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）测定蛋白质分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量

一、实验目的： • 1.学习 SDS-PAGE分离蛋白质的原理； • 2. 学习垂直板电泳的操作方法。

二、实验原理 • 1、电泳： • (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷 • 相反的电极方向移动的现象。

(2)影响电泳效果的因素： • ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； • ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； • ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；

④溶液的pH值： 影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； • ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； • ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； • ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； • ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） • (1)定义 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 • SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基磺酸钠）

(2)SDS的作用 • SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。 • 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 • 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小

(3) SDS-PAGE分类： • SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： • 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 • 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳

(4)聚丙烯胺凝胶的生成： • 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 • 引发产生自由基的方法有两种： ①化学法 ②光聚合法

①化学聚合： 引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’ －四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶； • ②光聚合：催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。

5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点： • ① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； • ② 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质； • ③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用； • ④ 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； • ⑤ 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

(6)凝胶的质量决定因素： • （1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。 • （2）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数，用C%表示。 • 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。

(7)不连续PAGE的原理： • 第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 • 第二、不连续系统中的三种物理效应： ①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应:

三、实验材料、仪器和试剂： • 1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶) • 2、仪器、器皿： • (1)垂直板电泳装置 • （电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； • (2)稳流稳压电泳仪；（3）高速冷冻离心机； • （4）电子天平；（5）电冰箱； • （6）瓷盘、微量进样器；

3、试剂： • （1）丙烯酰胺凝胶贮液（Acr-Bis贮液）； • （2）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）： • （3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）： • （4）10%SDS溶液： • （5）过硫酸铵溶液，简写Ap （当天配制）； • （6）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)； • （7）样品提取液： • （8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液） • （9）40%蔗糖： • (10)染色液 • (11)脱色液

四、实验步骤： • 1、贮液的配制： • 2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备： • 3、蛋白样品的制备： • 4、装槽、点样： • 5、电泳： • 6、剥胶、染色、脱色：

2.1 胶板的制备：

3、植物组织蛋白质提取： • 称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加入3ml样品提取液，在冰上静置（3小时）。 • 4℃条件下，11100rpm离心20min，提取上清夜，样品制备完成。

4、装槽、点样： 取出胶板下端胶条→用滤纸擦净凡士油→ 将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内 → 上下槽装电极缓冲液。

5、电泳： 接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm 停止电泳。

6、剥胶、染色、脱色： 将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入染色液，过夜。染色完毕后，倒出染色液，并换脱色液5-6次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止。

五、结果与计算： 绘制蛋白质谱带，计算出迁移率；

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