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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) . Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005. A invenção da PCR. 1983 Kary Mullis 1985 1º paper 1993 Nobel da Química. PCR, a ferramenta do futuro. Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo

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Polymerase Chain Reaction (PCR)

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Presentation Transcript

  1. Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005

  2. A invenção da PCR • 1983 Kary Mullis • 1985 1º paper • 1993 Nobel da Química

  3. PCR, a ferramenta do futuro • Grande quantidade de DNA em pouco tempo. • Baixo custo • A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada. • PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA. • O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.

  4. A reacção

  5. O que envolve a reacção? • DNA Template • Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino) • Nucleótidos (dNTPs) • Primers • DNA polymerase (pex: Taq, Pfu)

  6. Quantos ciclos?

  7. Termo-Cicladores

  8. Funcionou? • Se não…o que fazer?

  9. Optimização da reacção de PCR • Temperatura • Tempos • Concentração de Mg2+ na reacção. • Quantidade de template e de polymerase

  10. DNA polimerases.. • E. coli • Taq • Pfu – proofreading • rTth DNA Polymerase

  11. Fidelidade da reacção • A Taq comete ERROS • Qual a importância dos erros? • Como superá-los?

  12. Concepção dos PCR Primers • Comprimento: especificidade vs eficácia • Temp de annealing • Composição de bases • Extremidade 3’ • Regiões repetitivas do DNA • Enzimas de restrição • Estrutura secundária • Homologias Intra e Inter-primer

  13. Primers a formar Hairpins e Dímeros • Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin: • Dímero de primers (intra ou inter primer).

  14. Aplicações do PCR • Multiplex PCR • Real Time PCR • PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas • PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA • PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas • PCR assimétrico • PCR e clonagem de DNA genómico • PCR e clonagem de cDNA • PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética

  15. Multiplex PCR

  16. Real time PCR

  17. PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas

  18. Para detectar polimorfismos de local de restrição • O que são polimorfismos? • Porque existem os polimorfismos? • Como se detectam esses polimorfismos?

  19. PCR específico para um alelo e detecção de mutações • Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo? • Um só nucleotídeo faz a diferença? • Como se interpretam os resultados?

  20. PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA • Qual a vantagem?

  21. Linker-primed PCR • Como decorre? • O que é o linker? • Que primers são usados?

  22. PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada • Qual a vantagem?

  23. PCR inverso • Quando se utiliza? • Como são os primers? • Como decorre o processo?

  24. Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA

  25. PCR assimétrico • Com que fim se utiliza? • Porquê assimétrico?

  26. Clonagem de DNA genómico ↓ Clonagem de cDNA ↓

  27. PCR e DNA Fingerprinting Exemplo: “locus” D1S80

  28. PCR e DNA Fingerprinting • Suas principais aplicações: • Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime) • Filiação genética (ex. testes de paternidade)

  29. PCR e Filiação genética Pai Mãe

  30. O futuro da PCR PCR ↔ material genético Fotocopiadora ↔ material escrito tornando a cópia fácil, barata, acessível

  31. O futuro da PCR Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.

  32. Agradecimentos • Este trabalho foi possível com a ajuda de.. • Drª. Clara Monteiro • Drª. Susana Pereira, IBMC • Drª. Marta Pinto

  33. Referências • Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA • James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New York,Scientific American Books • Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition • Alkami quick guide tm for PCR • Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004 • A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade • Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR) • Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books

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