The Human Genome

1. The Human Genome ~ 32,000 Genes ?? 200,000 Proteins a) alternative mRNA splicing b) post-translational modifications

3. Régulation Transcriptionnel Pourquoi est-ce que l’expression génique est régulée ? Pourquoi la transcription est-elle le mode primaire de la régulation de l’expression d’un gène? Quel est le principal moyen de régulation de la transcription ? Comment est-ce que ceci est réalisé ?

4. Le but principal du control de l’expression des gènes chez les organismes pluricellulaires est l’exécution des décisions précises au bon moment et dans les cellules appropriés au cours du développement et de la différentiation cellulaire.

5. Regulation Can Be at Several Different Levels GENOME TRANSCRIPTOME PROTEOME Nucleus Gene Expression: Multiple, Spatially and Temporally Distinct Steps Carried out by Distinct Cellular Machinery DNA Cytoplasm Pol II transcription Primary RNA transcript Protein Degradation Nuclear processing Capping Splicing Polyadenylation Translation Post-Translational Modifications Mature mRNA Mature mRNA Degradation Export - Dynamic Protein Association

6. Gene expression is regulated at several levels : 1) Transcriptional – the most common way of controlling levels of a transcript (and therefore also the protein it encodes) 2) Post- transcriptional – regulation of aspects of the RNA after it is transcribed, for example, alternative splicing, polyadenylation, capping, transport out of the nucleus, and half- life 3) Translational – factors that affect the efficiency with which an mRNA is translated, such as mRNA capping, tRNA abundance, and modification of initiation factors (eIF- 2phosphorylation for example) 4) Post- translational – regulation at the protein level, mechanisms include protein stability,Covalent modification of the protein (Phosphorylation, Acetylation, Methylation, Ubiquitination, Sumoylation…), protein localization and protein degradation

7. Le control de la transcription est le principal moyen de régulation de l’expression de gènes

9. DNA Condensation 2 mètres d’ADN par cellule dans 2 x 10-9 cm3 (ou millilitres) 5 x 1010 kilomètres d’ADN par être humain

10. Euchromatin open, transcriptionally active Heterochromatin condensed transcriptionally silent

13. HISTONES • form the NUCLEOSOME, • which DNA loops around. • EUCHROMATIN – • less compact; • actively transcribed • HETEROCHROMATIN – • more compact; • transcriptionally inactive. • Heterochromatin can be either constitutive or facultative.

14. Levels of Chromatin Assembly Inactive Solenoid 30 nM structure Dnase I insensitive Active Beads-on-a-string structure Dnase I sensitive 10-fold Open Nucleosome-free Dnase I hypersensitive 100-fold

16. Chromatin Structure • Core particle - 146-147 bp • Wrapped twice around histone octamer • H2A, H2B, H3, H4 • Linker DNA ~15 - 55 bp • H1 histone - linker associated

17. Modèle d’empaquetage de la chromatine

18. Structure d’un Nucleasome Histones : H2A = jaune H2B = rouge H3 = bleu H4 = vert ADN vert et marron

20. Components of the Transcriptional Machinery • RNA Polymerase • Basal transcription factors • Sequence-specific transcription factors • Co-activators/repressors bridging the basal machinery • and the other sequence-specific regulators • Enzymes that covalently modify core histones and • other chromatin components • Enzymes that alter chromatin structure in an • ATP-dependent manner

21. Basal Gene Expression Pre-initiation complex assembly • Consensus cis-acting elements • TATA box • Initiator Element • CCAAT box • General transcription factors • TATA Box binding Protein (TBP) • TBP Associated Factors (TAFs) • Mode of assembly • Holoenzyme • Sequential assembly

22. TAFs • Basal, Very Low Level • mRNA Expression • Detectable with RT-PCR • No protein production TBP Gene X -35 Basal Transcription

23. Regulated Transcription 1. Cis-acting sequences 2. Transcriptional activators/co-activators 2,000 + transcription factors Combinatorial complexity

24. Transcription Factors 1. Proteins (and RNA’s?) that regulate (positively or negatively) transcription initiation 2. Can act via sequence-specific DNA-protein interactions, or via protein-protein interactions 3. Many transcription factors bind to cis-acting regulatory DNA sequences (regulatory elements in DNA) associated with genes 4. Includes: general transcription factors, upstream activators, enhancer-binding proteins, cell-type-specific factors, co-activators, etc.

25. Les facteurs de transcription, qui stimulent ou répriment la transcription, se fixent à des éléments régulateurs proches de du promoteur et des amplificateurs

26. Les facteurs de transcription, sont des protéines modulaires contenant un domaine de liaison à l’ADN et un ou quelques domaines d’activation ou de répression

27. Le rôle principal des activateurs et des répresseurs de la transcription eucaryotes consiste à se fixer à des complexes à sous unités multiples que régulent la transcription soit en modulant la structure de la chromatine (effet indirect) soit en interagissant avec la polymérase II et les facteurs généraux de la transcription (effet direct)

36. Co-activator protein Transcriptional activators binding to promoter region General transcription factors TBP Gene X TATA -35 Regulated Transcription

38. Les activités de nombreux facteurs de la transcription sont régulées directement par son interaction avec des hormones et indirectement par la fixation de protéines et de peptides extracellulaires à des récepteurs présentes à la surface des cellules. Ces protéines constituent donc des cibles moléculaires pour des médicaments agissant comme agonistes ou antagonistes afin de réguler l’activité cellulaire à travers l’expression génique.

40. Les récepteurs nucléaires constituent une superfamille de facteurs transcriptionnels dimériques à doigt à zinc C4 qui fixent des hormones liposolubles et interagissent avec des éléments spécifiques de réponses dans l’ADN. La liaison des hormones aux récepteurs nucléaires induit des changements conformationnels qui modifient leur interaction avec d’autres protéines

41. Les récepteurs nucléaires hétérodimériques (récepteurs de l’acide rétinoïque, de la vitamine D ou de l’hormone thyroïdienne) sont présents uniquement dans le noyau. En l’absence d’hormone ils répriment la transcription de gènes cibles, une fois leur ligands fixés ils activent la transcription.

42. General Scheme for Activation of Gene Transcription by Nuclear Hormone Receptors

43. Les récepteurs des hormones stéroïdes sont des récepteurs nucléaires homodimériques. En l’absence d’hormone, ils sont piégés dans le cytoplasme par des protéines inhibitrices. Une fois associés a leur ligands, ils peuvent subir une translocation vers le noyau et activer la transcription des gènes cibles.

45. Epigenetics “Any heritable changes in gene expression (influencing on gene function) that occur without a change in DNA sequence” Such changes cannot be attributed to changes in DNA sequence (mutations) but they can be as permanents as mutations (difficult to reverse)

46. Major mechanisms of epigenetic changes Three important factors that play clear roles in transcriptional regulation are known: • DNA METHYLATION – A subset of cytosine (C) residues could be modified by methylation. • HISTONE ACETYLATION Histones can be modified by acetylation. - IMPRINTING (non-coding RNAs involved)

47. Histone acetylation and gene expression • HISTONES in transcriptionally active genes are often ACETYLATED Acetylation of lysine residues in histones : • Reduces positive charge, weakens the interaction with DNA. • Makes DNA more accessible to RNA polymerase II • Enzymes that ACETYLATE HISTONESare recruited to actively transcribed genes. • Enzymes that remove acetyl groups from histonesare recruited to methylated DNA. There are additional types of histone modification as well, such as methylation of the histones.

48. Histone Acetyltransferase (HAT) Complexes P300/CBP PCAF TAFII 250 • Conserved lysines in the N-terminal tails of histones • Post-translational - Reversible • Localized - ~2 nucleosomes • Can also acetylate other proteins involved in transcription Histone Deacetylation Complexes (HDAC)

49. Histone acetylation² Histone acetyltransferase Hypoacetylation Strong internucleosomal interactions: Histone deacetylase • Acetylation has two functions: • Neutralize the positive charge on the lysine residues • Destabilize interactions between histone tails and structural proteins Hyperacetylation (Yellow) Weak internucleosomal interactions: histone tails do not constrain DNA, which is accessible to transcription factors

50. Mitosis does not erase acetylation, but merely distributes histones, between the daughter chromosomes. Specific acetyltransferases (red) end up distributed between the daughter chromosomes, too. Once segregated, an acetyltransferase would acetylate the adjacent nucleosomes (yellow) and thereby spread over the entire chromatin domain.