1 / 20

Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás. A nukleinsav kimutatás. etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid l g =254-366 nm l e =590 nm. Br -. X= O: YOYO-1 X= S: TOTO-1. A C. A G C T. OH. A C. G. 3’. 3’. 3’. P. P. P. P. P. OH. 5’. 5’. Rövidítések. bázis.

evadne
Download Presentation

Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

  2. A nukleinsav kimutatás etidiumbromid3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromidlg=254-366 nm le=590 nm Br - X= O: YOYO-1 X= S: TOTO-1

  3. A C A G C T OH A C G 3’ 3’ 3’ P P P P P OH 5’ 5’ Rövidítések bázis 3’ 3’ 5’ 5’ cukorrész foszfodiészter kötés pApCpG [ACG]

  4. A C A G C T OH A C G 3’ 3’ 3’ P P P P P OH 5’ 5’ Rövidítések bázis cukorrész 3’ 3’ 5’ 5’ foszfodiészter kötés pApCpG [ACG]

  5. 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAGC 5’ 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’ Szekvencia meghatározása 1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel(W. Arber, H. Smith, D. Nathans) törzs EcoRI E.coli Cél: feldarabolás Hae III Néhány II-es tipusú restrikciós enzim (>2000)

  6. 2a. Kémiai módosítás/hasítás(A. Maxam, W.Gilbert, 1977) 1. lépés Homogén „Single-stranded”DNS minta előállítása 5’ATTGACTTAGCC3’ Jelölés 5’-végen 32P (*)(polinukleotid kináz) 2. lépés *ATTGACTTAGCC 12 mer 3. lépés Kémiai hasítás C reakció G reakció A reakció+G reakció T reakció+C reakció *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT 4. lépés: elektroforézis5. lépés: autoradiográfia 6. lépés: szekvencia leolvasás

  7. 7 + 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Kémiai hasítás: Purinok G reakció OH - Dimetilszulfát + piperidin 5’ b a 3’ OH -

  8. 3 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ A > G: A reakció Dimetilszulfát 0 oC, 0,1 M HCl2 óra pH 7 90 oC + OH -

  9. Kémiai hasítás: Pirimidinek 5’ 5’ 3’ timin 3’ citozin hidrazin 3 3 Urea 2 1 + 4-Me-3-pirazolon 3-amino-pirazol 2-dezoxiribozil-hidrazon piperidin 3’ Hasítás a 3’ végen

  10. 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ A. C + T: T reakció hidrazin piridin OH -

  11. 5’ 3’ 5’ 3’ B. C reakció 5’ 5’ hidrazin1 M NaCl + 3’ 3’ piridin 5’ + 3’ 5’ OH - + 5’ 3’ 3’

  12. Példa: G hasítás után Fragmens hossz 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 *ATTGAACTTAGCC Elektroforézis *ATTGAACTTA AACTTAGCC AACTTA *ATT CC + + Autoradiográfiás módszerrel jelzettgél („izotóp” csik) Színezékkel festett(minden csik)

  13. Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés

  14. 2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer(F. Sanger et al., 1977)

  15. 32 2b.1 Didezoxi nukleotid jelölése Radioaktív izotóp (32P) 32P Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. Hood, 1986)

  16. 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAA 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGATTA 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGA 2b.2 A DNS-polimeráz müködésének blokkolása szekvenálandó DNS primer DNS polimeráz IdATP, dTTP, dCTP, dGTP+ didezoxi analóg (ddATP) 4 edény4 analóg +

  17. 2b.3 Gélelektroforézis Leolvasás - komplement szál

  18. 3’ 5’ 5’ 3’ DNS polimeráz ddATP ddCTP ddGTP ddTTP (32P) DENATURÁLÁSELEKTROFORÉZISAUTORADIOGRÁFIA T C G A

More Related