1 / 30

Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése

Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése. 2014.04.08. Miről fogunk tanulni?. Proteinek kinyerése komplex mintákból (szövet, fermentlé stb.) Nem protein jellegű szennyezők ( lipidek , nukleinsavak, stb.) eltávolítása

jag
Download Presentation

Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Fehérjék, peptidekmintaelőkészítése 2014.04.08.

  2. Miről fogunk tanulni? • Proteinek kinyerése komplex mintákból (szövet, fermentlé stb.) • Nem protein jellegű szennyezők (lipidek, nukleinsavak, stb.) eltávolítása • Protein szennyezők eltávolítása (precipitáció, frakcionálás, szelektív jelölés) • Mérésnek megfelelő koncentráció beállítása

  3. Analitikai célú (kis térfogatú) vizsgálatok • Proteomika (összetétel, funkció, változás) • Klinikai vizsgálatok (kórképek, terápia) • Szerkezeti vizsgálatok (mutáció, PTM) • Térbeli elhelyezkedés (sejtek közti különbségek)

  4. Nehézségek-mielőtt hozzákezdünk • Nagyfokú diverzitás (összetétel, koncentráció) élesztősejt: 50-106 db/sejt vérszérum: 60-80 mg/L (3/4 Alb + Ig) mAb: 150 kDa, 108 dbelméleti variáns Jól definiált std-ek hiánya Analitikai problémák: 2-3 nagyságrend tartomány (5-12 mintában) felbontóképesség (komponensek száma nagy) érzékenység nem elég (abundáns fehérjék) Minta stabilitása: homeosztázis, proteázok, precipitáció, adszorpció, műtermékek

  5. Plazma proteinek

  6. Néhány szám-komplexitás

  7. Jó mintaelőkészítési protokoll:univerzális mátrixra, szelektív analátra, nem változtatja meg az analátot NINCS (elfogadható van) Lehetőleg kevés lépésből áll (veszteségek) Tisztázni kell: analitikai cél minta forrása, mennyisége technikák alkalmazhatósága (pl. LOQ) mintaszám: idő/költséigény protokoll kidolgozása (irodalom, tapasztalat, intuíció) legyen több alternatíva

  8. Néhány analitikai technika teljesítménye

  9. Mintatípusok Nedvek: vér, vizelet, stb. relatíve homogének, alacsony enzimaktivitás, egyszerű kezelés Szövetek: feltárás szükséges, homogenizálás, magas enzimaktivitás, proteinek beoldása Rekombináns sejtek: sejtes elemek feltárása, majd hasonlóan a szövetekhez

  10. Minták stabilizálása Fagyasztás folyékony nitrogénben Kémiai/fizikiaidenaturáció (sók, szerves osz., T) Stabilizáló enzimek (pl. proteáz inhibitorok) Precipitáció (visszaoldás?) Gyors, kontrollált hőmérsékletű feldolgozás

  11. Sejtfeltárás (lízis: lágy, moderált, kemény) Megfelelő hatásfokú feltárás, a célprotein beoldása Zavaró komponensek kicsapása Frakcionálás: centrifugálás hatásfok Károsodás veszélye

  12. Stabilizáció Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: megelőzés: Lágy lízis, enzimgátlás (hő: irreverzibilis denat., kémiai: reverzibilis, aktivitás megőrízhető):

  13. Stabilizáció 2. Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: Oxidáció: redukálószer (DTT) Konformációváltozás: fiziológiás extrakció: T: 36°C, pH: 7.4 10mM foszfátpuffer, ionerősség: 0.15 M NaCl Oldatban tartás: Hofmeister-sor (1888, tojásfehérjék) Detergensek: SDS, oktil-glikozidok, stb. precipitál: hidrofób kölcsönhatások erősítése szolvatál: hidrofób kölcsönhatások gyengítése (kaotróp), denaturáció

  14. Példa protokoll: szöveti fehérjék vizsgálata • Mintavétel: izomszövet (tárolás: foly. nitrogén) • Homogenizálás: fagyasztva őrlés • Extrakció: extrakciós puffer, ultrahang • Fázisszeparálás: centrifuga (20000g, 20min) • Felülúszó további előkészítése, pl. proteolízis • Minta vizsgálata

  15. Minta vizsgálata (mátrix egyszerűsítés) • Differenciálprecipitáció • Prefrakcionálás (IEF, 1-2D SDS PAGE, IEX, SEC, RP) • Immunodepletálás (abundánsok eltávolítása) • Immunodúsítás (pl. foszfo/gliko stb. proteinek/peptidek) • Membránszűrés (3-100 kDa MWCO)

  16. Differenciálprecipitáció

  17. SDS-PAGE Futtatás Festés Kivágás Visszoldás MS Lassú (tiszta minta) • SEC Frakciószedés Dúsítás-sómentesítés MS Gyors (komplexebb minta)

  18. Immunodepletálás/immunodúsítás

  19. Membránszűrés

  20. HTS módszerek (sok minta)

  21. Szerkezetvizsgálatok-mintelőkészítés (mAb példája) Intakt fehérjék nehezen vizsgálhatók: LC: diffúzivitás (anyagátadási ellenállás) adszorpció (T, additív, P) MS: tömegtartomány (m/z 2-10000:Q, ToF) felbontás (Gln:128.14, Lys:128.17; 50000 (1500 Da peptid)) Megoldás: karakterizáljuk a peptideket!

  22. mAb Szekvencia (de novoszekvenálás) Proteolízis: tripszin (Lys, ArgC-term), pepszin, kimotripszin, Glu-C, stb.. peptidekszekvenálása MS-ben 100% lefedettség kell (nagyon nehéz, több enzimet kell használni) Töltésvariánsok PTM Aggregáció És ez még messze nem elég!!!!

  23. proteolízis protein oldat pH beállítás S-S redukálás (DTT), denaturáció (detergens alkilálás (IAA) pH, T beállítás tripszines emésztés:1000-1500 Da peptidek (autoproteolízis gátolt, specificitás?) peptidek (nano)LC-MS/MS

  24. LC-MS/MS • Adatfüggő analízis • Target analízis

  25. Töltésvariánsok: IEC (papain)

  26. Oxidált variánsok: RP (DTT)

  27. Fragmensek, aggregátumok: SEC

  28. Konklúziók • Érzékeny, bonyolult minták • Többlépéses mintaelőkészítés • Protokollt a feladat határozza meg • Költségesebb • Nagyobb körültekintést igényel • Kisebb reprodukálhatóság • Aki jól csinálja, annak lesz munkája

More Related