Preparazione di uno striscio per la colorazione

1. Preparazione di uno striscio per la colorazione I microrganismi differiscono chimicamente e fisicamente tra loro e per questo reagiscono in maniera differente alle colorazioni. Prima della colorazione occorre fissare le cellule da osservare sul vetrino, per evitare che vengano rimosse durante i passaggi della colorazione. PROCEDURA (4) Fissare la patina sul vetrino passandolo rapidamente attraverso la fiamma del becco Bunsen tre volte (1) Porre un’ansata della coltura su un vetrino pulito* (2) Stendere la coltura sul vetrino formando una sottile pellicola (3) Essiccare all’aria (1) Oppure in caso di colture da terreno solido, aliquotare 10 l di soluzione fisiologica sul vetrino e stemperarvi dentro una piccola quantità di cellule prelevate con un’ansa o stecchino. (2) Stendere bene per evitare di formare uno striscio troppo spesso. (3) Vedi figura. (4) Attenzione, troppo calore distorce le forme e le strutture delle cellule creando artefatti.

2. Colorazione differenziale di Gram Usando diversi coloranti (colorazione policromatica) possiamo differenziare tra microrganismi. La colorazione policromatica di Gram consente di suddividere i batteri in due gruppi: gram-positivi e gram-negativi, grazie alla diversità delle loro pareti. La colorazione di Gram richiede l’uso di 4 soluzioni: Soluzione 1, un colorante basico – cristal-violetto. Soluzione 2, un mordente come iodio – soluzione di Lugol: accresce l’affinità tra la cellula e il colorante e fissa il colorante sulla cellula rendendo più difficile la decolorazione. Soluzione 3, un agente decolorante – alcol 95%. Alcune cellule si decolorano più facilmente di altre permettendo la differenziazione tra batteri. Soluzione 4, il colorante di contrasto – safranina. E’ un colorante basico di colore diverso dal cristal-violetto. Quei microrganismi che risultano resistenti alla decolorazione trattengono il colorante basico iniziale (batteri gram-positivi), gli altri (batteri gram-negativi) assumono il colorante di contrasto. Per le colorazioni bisogna utilizzare colture fresche (di 18-24 h), perché le cellule da colture vecchie tendono a perdere la capacità di risposta selettiva. Procedura (5) Decolorare con Sol. 3 per 20-60 sec. (1) Colorare con Sol. 1 per 1 min. (6) Sciacquare con acqua. (7) Coprire con Sol. 4 per 1 min. (2) Lavare con Sol. 2 e poi con acqua. (8) Sciacquare con acqua (3) Coprire con Sol. 2 per 1 min (9) Assorbire l’acqua in eccesso e fare asciugare all’aria (4) Sciacquare con acqua