FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI • Corso di Laurea Magistrale in Genetica e Biologia Molecolare nella Ricerca di Base e Biomedica TESI DI LAUREA “Differenziamento mieloide: Analisi dell'espressione dell'enzima ADAR1 e della sua attività di RNA editing” RELATORECANDIDATA Prof.ssa Rosa Sorrentino Michela Gentile 1554897 Anno Accademico 2013/2014

2. COSA SI INTENDE PER RNA EDITING? L’insieme delle alterazioni post-trascrizionali delle sequenze di RNA che comprendono inserzioni, delezioni o modificazioni nucleotidiche WT Protein DNA pre-RNA WT Protein WT RNA DNA pre-RNA Edited Protein RNA Editing Editing In molti casi l’RNA editing non avviene sulla totalità delle copie di un trascritto (100% di efficienza) e la versione editata e non editata della proteina sono co-espresse nella cellula.

3. RNA EDITING A-TO-I

4. RNA EDITING A-TO-I Regioni codificanti nel pre-mRNA Regioni non codificanti nel pre-mRNA Zinshteyn and Nishikura 2009 RNA non codificanti: precursori miRNA pri-miRNA pre-miRNA Farajollahi and Mass 2010

5. GLI ENZIMI ADARs Negli eucarioti superiori la deaminazione dell’Adenosina in Inosina è catalizzata dalla famiglia delle ADARs (Adenosina DeAminasi Agenti sull’RNA a doppio filamento) p150 p110

6. RICONOSCIMENTO DEL SUBSTRATO La maggior parte delle interazioni tra le ADARs e il substrato avviene attraverso i domini dsRBDs Le ADARs agiscono attraverso un meccanismo chiamato "flip out" delle basi dell'RNA che devono essere deaminate Keegan et al., 2001

7. FENOTIPO DEGLI ANIMALI KNOCK-OUT Nel topo l'inattivazione di ADAR1 porta alla morte dell'embrione prima del quattordicesimo giorno con un'alterazione della struttura del fegato e conseguenti difetti nel sistema ematopoietico L'eliminazione di ADAR2 risulta letale; topi knockout per tale enzima muoiono subito dopo la nascita a causa di continue crisi epilettiche

8. RNA EDITING E CANCRO Gli astrocitomi pediatrici mostrano una diminuzione dell’attività di editing di ADAR2 (Cenci et al., 2008) Nel glioblastoma il mir 376 a non viene editato promuovendo la migrazione e l’invasione delle cellule (Choudhury et al., 2012) Cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) che esprimono la forma editata di AZIN1 presentano un'aumentata proliferazione (Chen et al., 2013)

9. RNA EDITING NELLE LEUCEMIE In pazienti affetti da leucemia mieloide acuta, trascritti di PTPN6, subiscono un editing aberrante con formazione di una proteina tronca (Beghini et al. 2000) L’enzima ADAR1 promuove la riprogrammazione dei progenitori mieloidi nella leucemia mieloide cronica (Abrahamsson et al., 2009; Perrotti et al., 2010) Nei bambini con leucemia acuta è emersa un’elevata espressione dell’isoforma p110 ma non di quella interferone-inducibile p150 (Ma et al., 2011) La delezione condizionale dell’enzima ADAR1 induce la regressione della leucemia mieloide acuta nei topi (Steinman et al., 2012)

10. SCOPO DEL LAVORO Analisi della variazione di espressione di ADAR1 nelle linee cellulari tumorali (U937 e THP1) e in cellule primarie (monociti isolati da donatori sani) durante il differenziamento terminale monocito-macrofagico Analisi del trascritto dell’enzima ADAR1 durante la maturazione macrofagica Analisi dell’attività di editing dell’enzima ADAR1 durante il differenziamento terminale monocito-macrofagico

11. L’ESPRESSIONE DELL’ENZIMA ADAR1 IN LINEE CELLULARI TUMORALI Stimoli: U937: 80nM PMA 96h o VitD3 (10nM) + GMCSF (25ng/ml) 96h THP1: 100nM PMA 96h o VitD3 (10nM) + GMCSF (25ng/ml) 96h U937 THP1 UNT PMA GM/CSF+ VitD3 UNT GM/CSF+ VitD3 PMA ADAR1 ADAR1 GAPDH GAPDH p21 p21 Isotipo di controllo CD14 e CD11b nelle U937 CD14 e CD11b nelle THP1

12. L’ESPRESSIONE DELL’ENZIMA ADAR1 IN LINEE CELLULARI TUMORALI L’incubazione delle cellule U937 e THP1 con PMA determina un aumento della proteina nel tempo 0 UNT PMA96h

13. ANALISI DELL’ESPRESSIONE DELL’ENZIMA ADAR1 IN MONOCITI UMANI ISOLATI DAL SANGUE PERIFERICO 2. SELEZIONE POSITIVADI MONOCITI CON MICROBEADS CD14+ Monociti 1. ISOLAMENTO DI PBMC DAL SANGUE PERIFERICO 3. TRATTAMENTO CON STIMOLI DIFFERENZIATIVI Monociti PBMC GM-CSF GM-CSF (100ng/ml 7gg) Macrofagi Isotipo di controllo CD14

14. ANALISI DEL TRASCRITTO DI ADAR1 DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO MONOCITO-MACROFAGICO B C A mRNA ADAR1( fold of expression) mRNA ADAR1 (fold of expression) mRNA ADAR1 (fold of expression) Monociti Resting GM-CSF 7gg U937 Unt U937 PMA 96h THP1 Unt THP1 PMA 96h

15. ANALISI DELL’ATTIVITÁ DI ADAR1 DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO MONOCITO-MACROFAGICO

16. ANALISI DELL’ATTIVITÁ DI ADAR1 DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO MONOCITO-MACROFAGICO 13 8 CDC14B appartiene alla famiglia delle tirosin-fosfatasi ed è coinvolta nell’ingresso in fase S permettendo la replicazione del DNA. L'attenzione è stata posta sulla porzione intronica 7-8 del pre-mRNA di CDC14B contenente due regioni Alu (AluJR e AluSx) 15% 8 13 Monociti 8 13 U937 30% 8 13 GM-CSF 30% 20% U937 96hPMA

17. ANALISI DELL’ATTIVITÁ DI ADAR1 DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO MONOCITO-MACROFAGICO K/R 1 2 K/R 1 2 NEIL1 è un enzima di riparo del DNA, appartenente ad una classe di DNA glicosilasi. Il trascritto endogeno della proteina è soggetto a due diversi eventi di editing che si verificano entrambi nel codone 242 dell'esone 6. 82% 40% 60% 27% Monociti U937 K/R 1 K/R 1 2 2 70% 40% 92% 50% U937 96hPMA GM-CSF

18. ANALISI DELL’ATTIVITÁ DI ADAR1 DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO MONOCITO-MACROFAGICO Y/C Q/R K/R BLCAP è una proteina altamente conservata presente in tutte le specie da C. elegans all’uomo. Di notevole interesse è la presenza di 3 siti di editing nella regione codificante del trascritto. Ciascuno di questi siti produce un cambiamento aminoacidico. 20% 15% Y/C Q/R K/R U937 15% Y/C Q/R K/R 30% 20% Monociti Y/C Q/R K/R U937 96hPMA 20% GM-CSF

19. CONCLUSIONI L’aumento dei livelli della proteina ADAR1 correla con il processo differenziativo, sia nelle linee cellulari che nelle cellule primarie Il trattamento con GM-CSF/VitD3 nelle linee tumorali induce un aumento meno marcato dei livelli della proteina rispetto al trattamento con PMA Il trascritto di ADAR1 nelle U937 non si modula dopo stimolazione con PMA; aumento invece osservato nelle THP1 e nelle cellule primarie L'aumento dell’espressione di ADAR1 è associato ad un lieve aumento della sua attività di editing

20. RINGRAZIAMENTI Prof.ssa Rosa Sorrentino Dott.ssa Maria Teresa Fiorillo Tutti i ragazzi del Lab Claudia,Valentina, Carolina, Giorgio, Fabiana, Manuela, Erminia, Nicla A voi tutti per l’attenzione