细胞凋亡（ APOPTOSIS ）

1. 细胞凋亡（APOPTOSIS）

2. 一 .细胞凋亡的研究历史 • 1.凋亡概念的形成和形态学的研究(1972） • 1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。 • 2．DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987） • 3. 蛋白质水解酶活化的研究(1995) • 4.细胞膜的变化(1997) • 5.线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-) • 1) 相关基因及调控 • 2）信号转导 • 3）各种分子及其相互作用及相互关系 • 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。

3. 二. 概念 • 细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。 • 细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） • PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。 • 细胞凋亡与坏死的区别

4. 细胞凋亡与细胞坏死的区别 特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 受累范围 单个细胞丢失 成群细胞死亡 膜完整性 保持到晚期 早期即丧失 细胞体积 减少、固缩 增大肿胀 染色质 凝聚成半月形 稀疏成网状 细胞器 无明显变化 肿张破坏 溶酶体 保持完整 破坏外溢 细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片 基因组DNA 有控降解 随机降解 大分子合成 一般需要 不需要 基因调控 有 无 后果 不引起炎症反应 引起炎症反应 意义 生理死亡方式 病理死亡方式

5. 三. 细胞凋亡的生物学特征 • 形态学变化 • 生物化学变化 • DNA片段化 • 大分子的合成 • tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。

6. 细胞凋亡的形态特征 • （1）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩，（2） 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围。 • （4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

8. 细胞凋亡DNA的片段化

9. 四. 细胞凋亡的过程及机理 • 接受凋亡信号 • 凋亡调控分子间的相互作用 • 蛋白水解酶（caspases）的活化 • 凋亡的级联反应

10. 细胞凋亡的两条通路：膜受体通路、线粒体通路细胞凋亡的两条通路：膜受体通路、线粒体通路

11. 膜受体的信号转导 • 参与死亡受体信号转导的接头蛋白： （死亡结构域蛋白death domain protein） • TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白 • TNF+TNFRI（死亡结构域）+ TRADD—细胞凋亡 • FADD：Fas相关死亡结构域蛋白 • FasL+Fas （死亡结构域）+FADD —细胞凋亡 • RIP：受体相互作用蛋白 • CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白 • MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白

12. (一) 细胞凋亡的膜受体通路 • FASL+FAS +FADD • 凋亡诱导复合物（DISC） • 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上 • 细胞有足够caspase8 细胞caspase8浓度不够 • 死亡受体活化， 切割Bid tBid从胞质到线粒体 • 细胞凋亡 • CtyC 释放

14. 线粒体与细胞凋亡 • 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径 • 释放caspase活化因子 • 细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+ caspase9—凋亡体 • AIF（凋亡诱导因子） • Caspase3 • Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子

15. (二) 线粒体通路

16. 五. 凋亡的效应分子 • 细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。 • 半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的词头)

18. Caspase家族的结构与分类 • ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用； Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11 Caspase12， • Caspase13， Caspase14。 • 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8， Caspase2， Caspase 9，Caspase10。 • 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3， Caspase6， Caspase7

19. Caspase家族的特点 • 以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用 • C端同源区存在半光氨酸激活位点 • Caspase分：启动酶和效应酶

20. Caspase活化机制： • Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。 • 首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,

22. Caspase的效应机制 • 凋亡细胞的特征性表现，包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。 • 破坏细胞抗凋亡因素 • 破坏细胞结构 • 影响核酸的结构与功能

23. 破坏细胞抗凋亡因素 • 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。 • 破坏细胞结构 • Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。6 • 影响核酸的结构与功能 • Caspase可作用于多种与DNA，RNA功能有关的蛋白如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。

25. 六.细胞凋亡的调节 • 1 . Bcl-2家族 • （B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖 。 • Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和BH4。 • 可分为3个亚族：

27. Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 • Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 • BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 • 作用机制：影响APAF1的功能 • 影响线粒体的结构与功能

30. 2. VDAC 和ANT • 是线粒体外膜上最为丰富的两种蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可与Bc1-2家族蛋白相互作用，在细胞凋亡过程中介导对线粒体的损伤。VDAC本身是一种通道蛋白，它与Bax的结合可使共通道性能发生某种变化，这样一些凋亡蛋白如cytC就可通过。因为这两种蛋白在跨越线粒体膜的核苷酸和小分子转运中起作用，所以它们与Bax的结合可能与细胞凋亡过程中线粒体ATP/ADP转化和磷酸肌酸外运的抑制有关。

31. 3. P53与细胞凋亡 • P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。

32. 4. IAP （inhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子） • IAP超家族的成员较多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个７０个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有环指装结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase－３和－７的泛素化降解作用。

34. 5. Smac/Dablo • 在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。成熟的Smac蛋白产生一个新的N基端,这个N基端的前面4个氨基酸可以与lAP的BIR结构域结合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9与lAP的结合。Smac 与BIR2的结合可以中和XlAP对胱解酶9的抑制，促进凋亡。

36. 七.细胞凋亡的生物学意义 • 细胞凋亡与个体发育 • 细胞凋亡与免疫 • 细胞凋亡与人类疾病

37. 免疫细胞凋亡 • 胸腺细胞成熟过程中的凋亡 阳性选择 • 阴性选择 • 激活诱导的细胞凋亡：（activation-induced cell death，AICD） • CTL诱导靶细胞的凋亡：穿孔素介导的靶细胞死亡 • Fas介导的靶细胞凋亡 • B细胞凋亡:经过基因重排,92%的细胞凋亡

39. 细胞凋亡与人类疾病 • 细胞凋亡受抑制有关的疾病 • 恶性肿瘤:滤泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病 • 自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、肾炎 • 病毒感染性疾病：腺病毒病、庖疹病毒病 • 细胞凋亡增多有关的疾病 • 艾滋病： • 神经变性性疾病：早老性迟呆、帕金森病、小脑退化病 • 骨髓发育不全性疾病 • 缺血性疾病 • 酒精中毒性肝炎

40. 八. 细胞凋亡的检测方法 • . 一、细胞凋亡的形态学检测 • . 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） • 三、线粒体膜势能（mt）的检测 • 四、DNA片断化检测 • 五、TUNEL法 • 六、Caspase-3活性的检测 • 七、WB检测 • 八、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析

41. 细胞凋亡的形态学检测 • 1 光学显微镜和倒置显微镜 • 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 • 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 • 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。 • 3 电子显微镜观察

42. Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process（488nm 400）

43. 电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

44. 磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析 （Annexin V法） • 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

46. PI Fluorescence Annexin V-FITC Fluorescence Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium

48. Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI

49. 线粒体膜势能（mt）的检测 线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

50. DNA片段化分析 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。