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LA RACCOLTA DELLE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

LA RACCOLTA DELLE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE. Stem cell. “Stem cell have received a large amount of attention recently, both in the scientific and the lay press.”. Ematologia Pesaro.

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LA RACCOLTA DELLE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

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Presentation Transcript

  1. LA RACCOLTA DELLE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

  2. Stem cell “Stem cell have received a large amount of attention recently, both in the scientific and the lay press.” Ematologia Pesaro

  3. “Long before the worldwide obsession with all type of stem cell started, the stem cells was fully accepted in the field of hematology”. Maximov in a scientific presentation in Berlin in 1909 ………..“gemeinsame Stamzellen” …….. Ematologia Pesaro

  4. La cellula staminale emopoietica: • - capacità di autorinnovamento*** • capacità di differenziarsi in progenitori commissionati°°° • °°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°° • ************************* Ematologia Pesaro

  5. Sorgente di cellule staminali per Trapianto di Midollo Osseo Allogenico Ematologia, Pesaro

  6. Da più di 40 anni è noto che i precursori emopoietici circolano nel sangue periferico e che possono essere utilizzati a scopo trapiantologico (Goodman et al, 1962) Allo steady-state le CD34+ rappresentano circa lo 0,1% di tutte le cellule nucleate nel S.P. La semplice somministrazione di chemioterapia aumenta di molte volte la quota di PBSC circolanti e questo avviene dopo 10-16 giorni dal trattamento (Tarella et al, 1991; Richman et al, 1977) Ematologia Pesaro

  7. Nel 1988 Duhrsen et al. osservarono che il G-CSF era in grado di aumentare considerevolmente il numero dei progenitori circolanti……. …..…e che era possibile raccogliere un numero sufficiente di queste cellule con procedure di leucoaferesi La somministrazione di G-CSF per 3-4 giorni determina un incremento significativo delle CD34 circolanti da 3,8 x 109/l a 61,9 x 109/l pari ad un incremento di 16,3 volte del loro basale…………. (Korbling et al, 1995) Ematologia Pesaro

  8. L’uso combinato di chemioterapia seguita da G-CSF aumenta ulteriormente la mobilizzazione ed è divenuto il metodo di più vasto impiego. (To et al, 1990; Gianni et al, 1989; Brugger et al, 1992) “ a variety of chemotherapy drugs have been used for mobilization” (Gillespie et al, 1996) Ematologia Pesaro Ematologia Pesaro

  9. Fattori che influiscono sulla raccolta delle PBSC: 1) Complessità biologica del CFU-GM assay, dipidendente da variabili: Presenti in vivo: - età - tipo di patologia - interessamento midollo osseo - precedenti chemioterapia (fludarabina, melfalan, ecc) Presenti in vitro: - tensione di ossigeno - fattori di crescita delle colonie: (siero fetale,fitoemoagglutinina) GM-CSF, G-CSF, IL3, IL6, stem cell factor e loro associazioni) - presenza di T linfociti e monociti 2) Diversità metodi di criopreservazione 3) Diversità criteri di valutazione 4) Mancanza di standardizzazione Ematologia Pesaro

  10. Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche (CSE) • CSE vitali per 2-3 giorni a temperature > a t. di congelamento • La criopreservazione mantiene inalterate le caratteristiche • biologiche oltre i limiti di tempo naturali. • Si esegue con congelatore programmato in azoto liquido • Possibili danni della crioconservazione: • 1. Cristalli di ghiaccio e danno degli organuli cellulari • 2. Cristalli di ghiaccio extracellulari e disidratazione delle cellule • 3. Reidratazione ed espansione delle cellule durante • lo scongelamento • 4. Funzionamento parziale degli enzimi cellulari a basse • temperature con possibile accumulo di metaboliti tossici • intermedi

  11. Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche (CSE) • Crioconservante: • dimetilsulfossido (DMSO) al 5-10% • (disidratazione parziale intracellulare) • Principi base: • DMSO aggiunto al plasma pochi ml alla volta mentre viene • raffreddato su ghiaccio (reazione esotermica) → midollo • Viene mantenuto lo stesso profilo termico delle componenti • della miscela • Controllo della velocità di raffreddamento

  12. Crioconservazione e scongelamento • A lungo termine a -196 °C, a -80°C per brevi periodi • Tempo 3-5 anni (max 10 anni ma con controllo della • vitalità) • Scongelamento delle sacche a bagno maria (37-38°C) • nel più breve tempo possibile • Reinfusione subito dopo lo scongelamento

  13. STEM CELL TRANSPLANTATION Which non-malignant diseases ? ALLO-SCT AUTO-SCT Aplastic Anemia Fanconi Anemia Hemoglobinopathies PNH SCI Wiskott-Aldrich syndrome Hereditary storage diseases Congenital leucocyte disfunctions Glanzmann and thromboastenia + + + + + + + + + - - - - - - - - - Ematologia Pesaro

  14. STEM CELL TRANSPLANTATION: Which malignant diseases ? ALLO-SCT AUTO-SCT AML CML IMF MDS HD/NHL MM HCL Infant blastomas Renal carcinoma Breast cancer Other cancers + + + + + + +/- +/- +/- +/- +/- + - + + + + +/- +/- +/- +/- +/- Ematologia Pesaro

  15. GITMO Allogeneic Transplants 2004

  16. LEUCEMIE ACUTE Ematologia Pesaro

  17. Use of peripheral blood stem cells for autologous transplantation in acute myeloid leukemia patients allows faster engrafment and equivalent disease-free survival compared with bone marrow cells. Visani G. et al Bone Marrow Transplant, 1999 91 AML patients: antracycline-based induction high-dose cytarabine consolidation from Jan 1993 to Jun 1996

  18. Use of peripheral blood stem cells for autologous transplantation in acute myeloid leukemia patients allows faster engrafment and equivalent disease-free survival compared with bone marrow cells. Visani G. et al Bone Marrow Transplant, 1999 88 AML evaluable patients: 73 CR 15 Resistant 16 ALLO BMT 44 AUTO 21 AMBT 23 PBSC (NOVIA+G-CSF) *neutrophil and plateled recovery shorter in PBSC * toxicity and relapse was similar

  19. Fludarabine-containing regimens severely impair peripheral blood stem cells mobilization and collection in acute myeloid leukemia patients. Visani G. et al Br J Haematol, 1999 31 AML pt induction/consolidation treatment containing fludarabine (ICE-FLAN-FLAN) RC= 68% after ICE and 84% after ICE-FLAN

  20. Fludarabine-containing regimens severely impair peripheral blood stem cells mobilization and collection in acute myeloid leukemia patients. Visani G. et al Br J Haematol, 1999 To mobilize PBSC 19 pz FLAN+ G-CSF(from day 13 at 10mg/Kg) 13 pt (69%) nonmobilizer Second mobilization with G-CSF: not achieved in 8/10 pt insufficient in 2/10 pt (<1x106 CD34+/Kg)

  21. Fludarabine-containing regimens severely impair peripheral blood stem cells mobilization and collection in acute myeloid leukemia patients. Visani G. et al Br J Haematol, 1999 harvest adequate in 92% (mean of 8,8x108/Kg nucleated cells) and ABMT performed in 10/12 pt

  22. “Esperienza di Pesaro”

  23. Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood stem cells after fludarabine-based regimens in acute myeloid leukemia Mele A*, Leopardi G*, Sparaventi G*, Nicolini G*, D’Adamo F*, Guiducci B*, Barulli S*, Malerba L*, Stramigioli S*, Talevi N*, Politi P°, Isidori A”, Malagola M”, Piccaluga P”, Visani G*. Department of Haematology, Hospital San Salvatore Pesaro* Trasfusional Centre-Hospital San Salvatore-Pesaro°, Institute of Haematology and Medical Oncology, “Seragnoli”, University of Bologna” Eur J Haematol, 2005 Ematologia Pesaro

  24. Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood stem cells after fludarabine-based regimens in acute myeloid leukemia. mobilization and collection of PBSC of a low dose regimen: 5-days-Mini-ICE administered after fludarabine based regimens in seven adult AML patients. - oral idarubicin 20 mg/mq on day 1, 3 and 5 - etoposide 100 mg/mq twice a day, days 1-3 - ARA-C 50 mg/mq s.c. twice a day for 5 days) Ematologia Pesaro

  25. Characteristics of patients submitted to Mini-ICE therapy Case Sex Age (y) FAB Karyotype diagnosis 1 2 3 4 5 6 7 F M F F F F M 29 34 56 63 33 33 40 M4 M0 M4 M0 M1 M4 M0 47XX+ 22; inv16 + 4 normal n. v. n. v. Inv.16, t(15;21) 47 XY+8 de novo de novo de novo post MDS de novo de novo de novo Ematologia Pesaro

  26. DCE (7) PR (1) NR (6) DCE II FLAG I CR (6) FLAG II CR (7) Mini-ICE + G-CSF(7) Harvest Abbreviation: DCE, daunorubicin, cytarabine, etoposide; PR, partial remission; NR, not responders; FLAG, fludarabine, cytarabine; CR, complete remission; Mini-ICE, idarubicine, cytarabine, etoposide; G-CSF, granulocyte colony stimulating factor. Ematologia Pesaro

  27. Table I. Characteristics of patients submitted to Mini-ICE therapy Case Sex Age (y) FAB Karyotype diagnosis apheresis (n) CD34+ cells (x 106/Kg) collected 1 2 3 4 5 6 7 F M F F F F M 29 34 56 63 33 33 40 M4 M0 M4 M0 M1 M4 M0 47XX+ 22; inv16 + 4 normal n. v. n. v. Inv.16, t(15;21) 47 XY+8 de novo de novo de novo post MDS de novo de novo de novo 1 1 1 2 2 2 2 10.9 10.1 15.2 3.08 3.1 4,49 8,1 Ematologia Pesaro

  28. Median number of harvested CD34+ cells was 8.1x106/Kg (range 3.08-15.2). All the patients were successfully submitted to PBSC transplantation. We suggest that the Mini-ICE program is feasible, well tolerated and effective in terms of PBSC mobilization and collection in “low yield” AML patients previously treated with fludarabine. Ematologia Pesaro

  29. Whatever mobilizing and/or releasing regimen is used, in a small proportion of patients a sufficient dose of PBSC cannot be collected (poor mobilizer)…… Ematologia Pesaro

  30. Pegfilgrastim effectively mobilizes PBSC in a poor mobilizer multiple myeloma patient: a case report Lara Malerba, Anna Mele,Giuliana Leopardi, Stefania Stramigioli, * Patrizia Politi, Giuseppe Visani Department of Haematology- Hospital San Salvatore- Pesaro, Italy, * Trasfusional Centre-Hospital San Salvatore-Pesaro, Italy Haematologica, in press Ematologia Pesaro

  31. December 2003, a 65-year-old man III A IgG/k multiple myeloma. • 3 couses of polichemotherapy (DC-IE):SD. • - cyclophosphamide (7g/sqm) plus daily 10 g/kg G-CSF in order to mobilize PBSC, without success. • After two months off therapy, the disease progressed and the patient received alternate cycles VAD/high dose dexamethasone. • A second attempt to mobilize PBSC, using daily 10 g/kg G-CSF after the second and third VAD cycle, failed. • Single dose of 12 mg pegfilgrastim • on day 5 after a fourth VAD course. • On day + 10 post chemotherapy the CD34+ cell count was 24/microlitre and two apheresis were performed, harvesting 1,6x106 and 0,89x106 CD34+ cell/kg, respectively;(total 2,49x106 cells/kg). • The only side effect was moderate skeletal pain. • The patient underwent successful transplantation. Ematologia Pesaro

  32. …..passaggio dal midollo al sangue periferico come fonte di cellule staminali SOURCE OF STEM CELLS

  33. A FAVORE PBSC • precocità e stabilità dell’attecchimento • equivalenza, se non addirittura riduzione, della incidenza e della gravità della GVHD acuta (Korbling et al, 2001; • Besinger et al, 2001) • recupero immunologico più veloce • riduzione dei tempi di ospedalizzazione • - ………..no anestesia generale e/o spinale Ematologia Pesaro

  34. CONTRO • incremento GVHD cronica (Brown et al, 1999) • …………”impegno prolungato” 5-7 giorni stimolazione, 2-3 leucaferesi, effetti collaterali, accesso venoso etc.. Ematologia Pesaro

  35. PROTOCOLLO PILOTA ESPLORATIVO DI APPLICAZIONE E DI STUDIO DEL TRAPIANTO APLO-IDENTICO DI CELLULE STAMINALI IN PAZIENTI AFFETTI DA EMOPATIE MALIGNE AD ALTO RISCHIO E/O RESISTENTI CHE NON DISPONGONO DI DONATORE FAMILIARE HLA IDENTICO O MISS-MATCH UNRELATED (MUD). Ematologia Pesaro Ematologia Pesaro

  36. L’esperienza di Pesaro Solo in casi selezionati vengono utilizzate PBSC (TMO aplo-identico; TMO con malattia in almeno II RC) Preferenza delle cellule staminali da Midollo Osseo!! Ematologia, Pesaro

  37. Probabilità di avere un donatore HLA identico… 25% familiare HLA identico 50-60% matched unrelated donor (MUD) …spesso però il tempo della ricerca è inconciliabile con l’urgenza clinica delle emopatie acute……. Ematologia Pesaro

  38. Per contro sono quasi sempre disponibili familiari (genitori, figli, fratelli) incompatibili per due-tre loci che possono essere immediatamente disponibili come donatori !! Ematologia Pesaro

  39. Concetto della Megadose MEGADOSE CD34+ (CD34+ > 106 cellule/Kg) in grado di consentire l’attecchimento con ricostituzione ematopoietica full-donor …rigetto mediato dai precursori dei linfociti T Citotossici del ricevente (CTL-P) Ematologia Pesaro

  40. TRAPIANTO APLO-IDENTICO • 2005……Pesaro • Concetto della Megadose (a+b) • a) PBSC con selezione in positivo • CD34+ mediante CliniMACS • b) midollo con selezione in negativo • (T deplezione) mantenendo quota linfociti T • CD3+ nell’inoculo (1,8x105/Kg) • effetto GVL Ematologia Pesaro

  41. Ragazza di 12 anni LAM M1 (trisomia del 4) diagnosticata nel giugno 2002 in seguito ad esami ematochimici eseguiti per “pallore” ed astenia Hb=4,2 gr/dl Bl=20% nel SP e 80% nel MO TERAPIE ESEGUITE c/o altro Centro: 21-27/6/2002: ICE secondo AIEOP LAM 2002 NR 8/2002 FLANG+Daunoxome NR 9/2002 MEC Persistenza di malattia Ematologia Pesaro

  42. Giunge alla nostra attenzione nel ott. 2002 con: GB=400 Hb=8,2 PLT=29000 Figlia unica, no donatori da banca………………… HLA-A HLA-B HLA-C Madre 01, 68 44, 53 04, 16 Figlia 01, 68 53, 57 04, 16 Ematologia Pesaro Ematologia Pesaro

  43. TRAPIANTO : Condizionamento: BU 16, Thiotepa 10, Endoxan 160, ATG 15mg/Kg.Profilassi GVHD: CSA, sMTX DON/RIC 0 NEG/B NEG REINFUSIONE CELLULE STAMINALI il 28-11-2002 con selezione in positivo CD34+ GVHD acuta +13 (metilprednisolone 2 mg/Kg) Mucosite grado II Ematologia Pesaro Ematologia Pesaro

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