CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI

1. CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI

2. CELLULE STAMINALI • Indifferenziate • Capaci di autorigenerarsi ( self-renewal) • Capaci di differenziarsi in tipi cellulari specifici • Capaci di ripopolare un dato tessuto in vivo

3. CLASSIFICAZIONE SULLA BASE DELLE FONTI DELLE CELLULE STAMINALI

5. TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi cellulari embrionali e non. • PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un embrione a sei settimane, le ES, cellule isolate da feto a termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti adulti). • MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells). • OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un ristretto subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge stem cells). • UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).

7. CELLULE STAMINALI ADULTE Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o tessuti adulti, capaci di AUTORIGENERARSI e di DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari del tessuto o organo preso in considerazione.

8. CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI • Sono conosciute anche come: • colony forming fibroblastic cells • stromal fibroblasts • marrow stromal stem cells • mesenchymal progenitor cells Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo, del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello stroma che supporta l’ematopoiesi.

9. MSCs e midollo osseo Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo risalgono al 1970. Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore allontanò le cellule non aderenti. Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da 3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare. Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla forma affusolata. 1/10000-100000 cellule nucleate umane

10. ISOLAMENTO DELLE MSC DA MIDOLLO OSSEO UMANO • Centrifugazione su gradiente di Ficoll • Coltura su piastre di polistirene non rivestite alla densità di 10000 cell/cm2 • 3. Rimozione cellule non aderenti

11. Centrifugazione su ficoll 4-5 ml di midollo in una siringa eparinata Cellule nucleate Piastrine, globuli rossi, granulociti polimorfonucleati Cellule nucleate: monocita, macrofago, cellula endotelilale adipocita Globuli rossi

12. 2. Coltura su piastre di polistirene non rivestite alla densità di 10000 cell/cm2 Dopo 24-48 ore 3. Rimozione cellule non aderenti Dopo 10-14 giorni Cellule subconfluenti Le cellule possono duplicarsi ed essere espanse per circa 20 passaggi mantenendo le caratteristiche di multipotenza senza ridurre il tasso di crescita. Le cellule così ottenute non hanno proprietà di cellule immortalizzate e hanno un tempo di crescita definita.

13. COME MIGLIORARE L’ISOLAMENTO DI MSC DA MIDOLLO OSSEO Abbinare alla centrifugazione su gradiente di Ficoll: • l’isolamento tramite separatore cellulare attivato a fluorescenza (fluorescence-activated cell sorter FACS) • immunoseparazione tramite colonnina

14. ISOLAMENTO TRAMITE SEPARATORE CELLULARE ATTIVATO A FLUORESCENZA(FACS) 1 2 3 4

15. ISOLAMENTO TRAMITE SEPARATORE CELLULARE ATTIVATO A FLUORESCENZA(FACS) • Una miscela di cellule viene marcata con un anticorpo fluorescente • Il tubo fotomoltiplicatore rileva la presenza di una cellula a cui è legato un anticorpo marcato e il computer la registra • Segnali provenienti dal computer caricano la gocciolina contenente una singola cellula marcata in modo da deviarla in un campo elettrico • Le cellule marcate con l’anticorpo possono essere separate da quelle non marcate

16. Svantaggi del FACS Sebbene il FACS sia un potente strumento di analisi: • esso esamina solo una cellula per volta • non può separare rapidamente ed economicamente il grande numero di cellule presente in un campione di midollo osseo.

17. IMMUNOSEPARAZIONE TRAMITE COLONNINA • Le cellule di interesse sono incubate con le biglie marcate con anticorpi contro specifici antigeni. • Il campione è caricato in una colonnina posizionata in un separatore magnetico. • Le cellule attaccate alle sfere (marcate) vengono trattenute mentre le cellule mancanti dell’antigene di membrana riconosciuto dall’anticorpo monoclonale vengono rimosse. • Le cellule legate vengono così selezionate positivamente per l’espressione dell’antigene, e possono essere recuperate tramite trattamenti in grado di spezzare il legame antigene-anticorpo, come ad esempio il calore o la forza meccanica. • Le cellule non legate vengono selezionate negativamente per la sua assenza e vengono lasciate decantare. www.miltenyibiotec.com

18. Selezione Negativa • Specifiche popolazioni possono essere selezionate a partire da una sospensione cellulare, eliminando le cellule non desiderate. Questa strategia è utile quando • le cellule di interesse sono molto rare e a bassa frequenza nel campione in esame • le cellule di interesse condividono l’espressione di alcuni antigeni con le altre nel campione in esame. www.miltenyibiotec.com

19. Esempi di Selezione Negativa • CD45. Antigene panleucocitario espresso su tutte le cellule della linea leucocitaria (granulociti, linfociti, monociti e loro precursori). • CD235a. Glicoforina espressa su eritrociti e loro precursori • Lineage cell depletion. Le cellule sono magneticamente marcate con un cocktail di anticorpi contro i cosiddetti antigeni “lineage”, CD2 (cellule T e NK), CD3 (cellule T), CD11b (cellule mieloidi), CD14 (monociti e macrofagi), CD15, CD16 (granulociti) , CD19 (cellule B e follicolari dendritiche), CD56 (cellule NK), CD123 (granulociti basofili) e CD235a (eritrociti) .

20. Svantaggi della selezione negativa A seguito della immunodeplezione le cellule si espandono molto poco probabilmente perchè i contatti cellula- cellula e le citochine rilasciate dalle popolazioni del midollo sono essenziali per l’espansione delle MSC.

21. Selezione Positiva • Specifiche popolazioni possono essere selezionate a partire da una sospensione cellulare, marcandole magneticamente. Questa strategia è utile quando le cellule di interesse sono molto rare e a bassa frequenza nel campione in esame www.miltenyibiotec.com

22. Esempi di Selezione Positiva • Stro-1. è un antigene espresso sulle MSC primarie, appena isolate da midollo; la sua espressione si mantiene in vitro in cellule non indotte a differenziamento. Le cellule positive a Stro-1 si espandono molto di più rispetto alle cellule isolate con il classico metodo di aderenza su plastica e rispondono bene ai differenziamenti. • In questi 14 anni dalla scoperta di STRO1 non c’è stato un grosso consenso da parte della comunità scientifica poiché molti gruppi non hanno confermato l’espressione di questo antigene sulle MSC. • è espresso su cellule positive per glicoforina e CD19 • CD105.Endoglina, funge da recettore per i fattori di crescita e differenziamento TGF-β1 e TGF-β3. Un epitopo di CD105 è riconosciuto dall’anticorpo SH2 molto utilizzato per identificare MSCs che mostrano capacità di differenziamento lungo il lineage mesodermico. • E’ espresso anche su cellule endoteliali. • CD117. c-kit, recettore di SCF (stem cell factor) è una glicoproteina di superficie con attività tirosin chinasi. • Circa il 25% delle cellule del midollo osseo CD117+ esprimono i marcatori ematopoietici CD34 e CD133. • Questo antigene è espresso su basofili, cellule dendritiche mieloidi, precursori T, precursori B, precursori K e blasti leucemici.

23. Esempi di Selezione Positiva II • CD271 è il recettore a bassa affinità di NGF, nerve growth factor. Esso è coinvolto nella morfogenesi di alcuni organi (rene) e nelle risposte apoptotiche in seguito a stimolazione con NGF. LNGFR è espresso sulle MSC primarie, appena isolate da midollo e la sua espressione si mantiene in vitro in cellule non indotte a differenziamento. Le cellule positive a LNGFR si espandono molto di più rispetto alle cellule isolate con il classico metodo di aderenza su plastica (differenze di 20-30 volte) e rispondono bene ai differenziamenti. - A seguito della selezione molte cellule del midollo osseo CD271+ esprimono i marcatori ematopoietici CD34 e CD133. • SSEA-4. Stage specific antigen-4 è una glicoproteina caratterizzata dalla presenza di residui carboidratici tipici dei glicolipidi. L’espressione di questa proteina è limitata alle cellule del teratocarcinoma umano e alle cellule embrionali prima dell’impianto in utero. Sebbene non sia ancora chiaro il ruolo di questa proteina nelle MSCs e se essa possa essere un marker di staminalità, è interessante osservare che oltre alle cellule pluripotenti ES e EC questi antigeni sono espressi anche sulle MSCs. Circa il 2-4% delle cellule del midollo osseo sono positive a SSEA-4.

24. SAGGIO DELLE UNITA’ FORMANTI COLONIE FIBROBLASTICHE (CFU-F) Un saggio utilizzato per determinare la frequenza di cellule mesenchimali staminali nel campione di midollo. Le cellule ottenute dal midollo osseo vengono piastrate a bassa densità (3500-8000 cell/cm2) dopo centrifugazione su gradiente di Ficoll, espanse come popolazione aderente e quantizzate contando le colonie derivate da una singola cellula aderente. Le colonie vengono poi espanse singolarmente, indotte a differenziamento e soggette ad analisi citometrica allo scopo di caratterizzarne la progenie.

25. CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC Non esistono antigeni specifici per MSC o che associano lo stato della cellula a uno specifico tratto fenotipico; dunque è impossibile determinare in una certa coltura cellulare la proporzione tra cellule staminali, progenitori multipotenti e precursori. MSC Mesenchymal stem cells HSC Hematopoietic stem cells CD34 Piuttosto dibattuta è l’espressione di CD34 che viene considerato un marker ematopoietico. Sebbene non sia espresso sulle hMSC espanse in coltura è espresso sulle cellule del midollo osseo fresco.

26. CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC

27. CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC

28. IL SISTEMA MESENCHIMALE Adattato da Falconi Stem Cells 2007

29. IL SISTEMA MESENCHIMALE Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214

30. Differenziamento osteogenico Il differenziamento delle MSCs in osteoblasti non è sorprendente; il midollo osseo è contenuto all’interno del canale diafisario delle ossa lunghe dove la struttura dell’osso è estremamente simile a quella dell’osso spugnoso che si rimodella continuamente, perciò non sorprende che campioni di midollo prelevati dall’osso possano contenere precursori di osteoblasti. Acido ascorbico Desametasone ΒGlicerofosfato Osteoblasti MSCs

31. Differenziamento osteogenico • Acido ascorbico (vitamina C): funziona come cofattore nella idrossilazione dei residui di prolina e lisina nelle molecule di collageno, promuovendo la formazione della matrice extracellulare, la maturazione e la deposizione di tutti i tipi di collagene; induce l’attività della fosfatasi alcalina della membrana plasmatica degli osteoprogenitori. • Β glicerofosfato: I fosfati organici promuovono la mineralizzazione dal momento che il fosfato viene incorporato nei cristalli di idrossiapatite della matrice. • Desametasone: promuove il differenziamento poichè è un agonista dei glucocorticoidi; esso agisce sui promotori responsivi dei fattori di trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel lineage osteogenico; promuove la calcificazione in vitro.

32. Differenziamento adipogenico La capacità delle MSCs di differenziare in adipociti può essere associata all’osservazione che il midollo viene in parte sostituito con l’adipe durante la vecchiaia. Insulina Desametasone 3-isobutil metilxantina Adipociti MSCs

33. Differenziamento adipogenico • Insulina: Promuove il differenziamento poichè attiva l’espressione di fattori di trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel lineage adipogenico; aumenta la percentuale di cellule che si differenziano e l’accumulo di lipidi nelle cellule. • Desametasone: promuove il differenziamento poiché è un agonista dei glucocorticoidi capace di agire su promotori responsivi dei fattori di trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel lineage adipogenico. • IBMX: è un inibitore non specifico delle fosfodiesterasi del cAMP e del cGMP. Il cAMP attiva la fosfochinasi PKA coinvolta in fenomeni di proliferazione, differenziamento e apoptosi.

34. Differenziamento condrogenico La capacità delle MSC di differenziare in condrociti può essere associata al processo di riparo di una frattura, poiché la cartilagine appare nei siti di frattura prima che il callo venga sostituito da osso. Acido ascorbico Insulina hTGFβ1 Poli- lisina Condrociti MSCs

35. Differenziamento condrogenico • Affinché le cellule possano differenziarsi in condrociti esse devono essere messe in condizioni colturali che mimino la condensazione cellulare che avviene in vivo. • Piastrare le cellule ad alta densità come micro-goccia su piastra • Far sedimentare le cellule nel fondo conico di una provetta. • TGF-b1 è un fattore di crescita coinvolto nella regolazione della proliferazione cellulare e nel differenziamento ed è importante per la formazione di osso e cartilagine. • Acido ascorbico (vitamina C): funziona come cofattore nella idrossilazione dei residui di prolina e lisina nelle molecule di collageno, promuovendo la formazione della matrice extracellulare, la maturazione e la deposizione di tutti i tipi di collagene. • Insulina: Promuove il differenziamento poichè attiva l’espressione di fattori di trascrizione necessari per il committment delle MSCs nel lineage condrogenico. • Poli lisina è una molecola poli-cationica che promuove l’interazione tra le cellule.

36. Differenziamento • Differenziamento Adipogenico (colorazione citochimica Oil Red O) • Differenziamento Condrogenico (immunocitochimica Collagene II) • Differenziamento osteogenico (colorazione citochimica fosfatasi alcalina) Pittenger M.F. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. 1999 Science 284:143-147

37. LA POPOLAZIONE ISOLATA IN QUESTO MODO E’ FORMATA DA UN PRECURSORE UNICO O SOLTANTO DAI PROGENITORI COMMITTED? Su 6 colonie ottenute da Pittenger et al. nel 1999 • - 6/6 si differenziano in senso osteogenico • 5/6 subiscono il differenziamento adipogenico • 2/6 quello condrogenico. • la popolazione isolata è mista cioé composta da una popolazione clonale staminale multipotente e da progenitori committed che perdono la potenzialità di seguire un certo lineage e mantengono esclusivamente una potenzialità • il protocollo di isolamento utilizzato o il numero di espansioni ha causato la perdita di quella capacità multipotenziale originariamente presente nelle cellule La popolazione isolata in questo modo è una popolazione clonale e multipotente

38. FUNZIONI DELLE MSC • supportare l’ematopoiesi • attrarre le HSC (hematopoietic stem cells) circolanti nel midollo (homing) • immunosoppressione

39. FUNZIONI DELLE MSC:supportare l’ematopoiesi Le MSC supportano l’ematopoiesi • attraverso interazioni cellula- cellula. Le HSC esprimono diversi recettori coinvolti nell’adesione delle cellule alla matrice extracellulare (i recettori della famiglia delle integrine, CD40, CD34 e CD43) • attraverso la produzione di fattori di crescita (IL-6, IL7, IL8, IL11, IL12, IL-14, IL15, LIF, M-CSF, SCF) Eckfeldt C.E. 2005. “The molecular repertoire of almighty stem cells”. Nature review Mol cell biol 6: 726-737

40. FUNZIONI DELLE MSC:attrarre le HSC nel midollo (homing) L’homing è il reclutamento delle HSCs circolanti nel midollo osseo. Questo processo si verifica • attraverso l’interazione cellula –cellula. Le HSC esprimono diversi recettori coinvolti nell’extravasazione (i recettori della famiglia delle integrine). • attraverso la produzione di fattori di crescita tra cui CXCL12, anche noto come SDF, stromal derived factor 1.

41. FUNZIONI DELLE MSC:effetto immunosoppressivo Le MSC hanno un ruolo importante nella maturazione dei linfociti T, B e NK e delle cellule dendritiche. Esse infatti inducono • l’arresto della divisione mitotica in Go-G1 e inibiscono l’espressione della ciclica D2. • Alterano la secrezione delle citochine nelle cellule T e il loro effetto citotossico. L’effetto immunosoppressivo delle MSCs sui linfociti T è ottenuto tramite • interazione cellula-cellula. L’interazione tra cellule T e MSC avverrebbe tramite alcune molecole espresse dalle MSC tra cui CD44 e CD117. • fattori solubili. TGFb1, HGF, NO, PGE2.

42. FUNZIONI DELLE MSC:santuario immunologico? • Le MSC esprimono MHC I a bassi livelli ma non esprimono le molecole MHC II né CD80 o CD86 che sono indispensabili per la stimolazione delle cellule T. • Le MSCs hanno un effetto immunosoppressivo sulle cellule T tramite interazione cellula-cellula (CD 44 e CD117, espressi anche sulle cellule epiteliali del timo) e tramite la produzione di specifiche citochine (TGFb1 e HGF). Le MSCs sono cellule immuno-privilegiate?

43. TERAPIE CLINICHE BASATE SU MSCs • Strategie di ingegneria tissutale • Terapia cellulare di “sostituzione” • Pompe di citochine e fattori di crescita

44. STRATEGIE DI INGEGNERIA TISSUTALE Un esempio di ingegneria tissutale è costituito dall’uso delle MSC nella riparazione di difetti ossei. La procedura prevede il caricamento delle MSCs su scaffold opportuni, cioè in grado di fornire uno stimolo osteogenico alle MSCs e un ambiente favorevole al differenziamento di queste cellule in osteoblasti. Bianco P. (2001) Stem cells in tissue engineering. Nature 414: 118-121

45. TERAPIA CELLULARE DI SOSTITUZIONE Esempio: terapia dell’ OSTEOGENESI IMPERFETTA Caplan A.I. “Mesenchymal stem cells: cell- based reconstructive therapy in orthopedics.” 2005. Tissue Engineering 11:1198-1211

46. POMPE DI CITOCHINE E FATTORI DI CRESCITA • Le MSC secernono molecole che stimolano l’angiogenesi e riducono i processi di fibrosi e cicatrizzazione. Questi effetti sono responsabili del ruolo terapeutico di queste cellule nell’infarto del miocardio o nell’ictus celebrale

47. FONTI DI CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI Agoaspirato midollare Tessuto adiposo Sangue periferico Sangue cordonale placenta

48. ISOLAMENTO DELLE MSC Le MSC del tessuto adiposo (ADMSC) hanno lo stesso potenziale differenziativo delle MSC del midollo osseo, vale a dire che possono differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti. Non stupisce che questo tessuto offra le stesse possibilità del midollo osseo dal momento che il midollo osseo e l tessuto adiposo hanno la stessa origine ontogenica, il mesoderma. Tessuto adiposo La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico (PB-MSC) è ancora molto dibattuta. La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa, tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in diverse condizioni patologiche, il numero di queste cellule aumenta. Non è chiaro la loro origine né la loro funzione in vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli organi periferici al midollo ma non è chiaro se possano persistere nel sangue e costituire una popolazione staminale residente. Sangue periferico

49. ISOLAMENTO DELLE MSC • Queste cellule (UCB-MSC) sono una fonte molto vantaggiosa di cellule staminali per diversi motivi: • sono piuttosto abbondanti • mancando degli antigeni MHC II non producono risposta immunitaria e rigetto • Possono essere congelate in banche cellulari • Tuttavia la presenza di MSC nel sangue cordonale è inversamente proporzionale allo stadio fetale e ciò significa che il numero di MSC nel cordone di un feto a termine è piuttosto esiguo. Sangue cordonale • Sono numerosi i tentativi di isolare cellule staminali dalla placenta al fine di • ottenere una fonte più accessibile di MSC rispetto a midollo osseo e tessuto adiposo • ottenere una fonte in cui la frequenza delle MSCs non sia esigua come nel sangue periferico o cordonale. placenta

50. BIBLIOGRAFIA • Deans R.J. Et al. “Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses” 2000. Experimenal hematology 28: 875-844 • Caplan A.I. “Mesenchymal stem cells: cell- based reconstructive therapy in orthopedics.” 2005. Tissue Engineering 11:1198-1211 • Pittenger M.F. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. 1999 Science 284:143-147 • Eckfeldt C.E. 2005. “The molecular repertoire of almighty stem cells”. Nature review Mol cell biol 6: 726-737 • Wilson et al. “Bone- Marrow hematopoietic stem cell niches”. 2006 Nature Reviews Immunology 6: 93-106 • Simmons P. J.(1991). Identification of Stromal Cell precursors in Human Bone Marrow by a Novel Monoclonal Antibody, Stro-1. Blood 78: 55-62