Katedra za biotehnologiju i farmaceutsko inženjerstvo ZAVRŠNI RAD

1. Katedra za biotehnologiju i farmaceutsko inženjerstvo ZAVRŠNI RAD MIKROBIOLOŠKA PROIZVODNJA ANTIBIOTIKA: CEFALOSPORINI Mentor: dr Jelena Dodić Student: Ivana Hrćan

2. ANTIBIOTICI • 1942. godine Vaksman je definisao antibiotike kao hemijske supstance proizvedene mikrobiološki, koje mogu da inhibiraju rast drugih mikroorganizama. • Imaju antibakterijsko ili antifungalno dejstvo, pojedini imaju i antitumorno dejstvo ili pak inhibiraju neke enzime. • Upotrebljavaju se u humanoj i veterinarskoj medicini. • Prema hemijskoj građi se dele na: • Tetracikline • β- laktamske antibiotike • Makrolidne • Linkozamide • Aminoglikozide • Glikopeptide

3. OTKRIĆE CEFALOSPORINA • 1945. godine italijanski profesor Giuseppe Brotzu započinje istraživanja • Fermentacioni bujon Cephalosporium spp. koji je izolovan iz mora u blizini kanalizacionog odvoda sadržao je nekoliko antibiotika • 1948. godine izolovani su cefalosporin C i P • 1949. godine izolovan je cefalosporin N • 1956. godine dejstvo cefalosporina C je ispitano na miševima • 1964. godine se prvi put pojavljuje na tržištu pod nazivom CEFALOTIN.

4. HEMIJSKA STRUKTURA CEFALOSPORINA

5. MEHANIZAM DELOVANJA CEFALOSPORINA • Prodiru u ćeliju kroz porine • Vezuju se za specifične bakterijske proteine • Osnovna uloga proteina je stvaranje i povezivanje peptidoglikana • Inaktivacija proteina vodi do smrti ćelije • Bakterija puca ili podleže lizi • Najosetljivija je u fazi deobe

6. POLUSINTETIČKI CEFALOSPORINI • Ciljevi polusinteze: • Povećanje stabilnosti u kiseloj sredini • Poboljšanje farmakokinetičkih osobina • Proširenje antimikrobnog spektra • Povećanje aktivnosti protiv rezistetntih mikroorganizama • Smanjenje osetljivosti na cefalosporine • Poboljšanje podnošljivosti nakon parenteralne primene • Cefalosporinsko jezgro služi za proizvodnju novih generacija cefalosporina. • Modifikacije je moguće izvršiti u položaju 3 i 7.

7. PODELA CEFALOSPORINA cefaleksin cefazolin cefadroksil I generacija: efikasni pre svega protiv Gram-pozitivnih mikroorganizama, koriste se u terapiji kože, uva, sinusa, ždrela, creva i mokraćnih puteva. cefuroksim cefahlor ceftibutem II generacija: imaju bolje dejstvo na Gram-negativne bakterije , prilično su efikasni i protiv Gram-pozitivnih bakterija. Imaju veću otpornost na β- laktamaze. cefotaksim ceftazidim ceftriakson III generacija: veoma efikasni protiv Gram-negativnih bakterija, deluju na Pseudomonas aeruginosa. cefpirom cefepim IV generacija: imaju još širi spektar dejstva, koriste se u terapiji infekcija respiratornog i urogenitalnog trakta

8. PROIZVODNI MIKROORGANIZAM • Acremonium chrysogenum , plesan iz roda fungi imperfecti • Gaji se submerznim postupkom • Filamentozne gljive su industrijski važni organizmi jer stvaraju sekundarne metabolite • Svi faktori koji utiču na gljivičnu morfologiju, uticaće i na produkciju sekundarnih metabolita.

9. PODLOGE ZA BIOTEHNOLOŠKU PROIZVODNJU • Hranljive podloge moraju da sadrže supstrate u obliku koji mikroorganizmi najbolje usvajaju. • U laboratorijskim uslovima se koriste sintetičke podloge tačno definisanog sastava. • U industrijskim biotehnološkim postupcima uglavnom se koriste prirodne hranljive podloge koje se pripremaju od jeftinih prirodnih sirovina biljnog ili životinjskog porekla. • Podloga mora da sadrži: • Izvore ugljenika • Izvore azota • Izvore fosfora • Mineralne materije • Amino kiseline • Biljna i životinjska ulja i masti

10. USLOVI BIOSINTEZE ANTIBIOTIKA Uspešno vođenje biotehnološkog procesa i postizanje visokih prinosa antibiotika osigurava se optimizacijom uslova kultivacije: • pravilan izbor sastojaka i optimizacija njihove koncentracije • rast čiste kulture mikroorganizama bez kontaminacije • snabdevanje kulture dovoljnom količinom kiseonika • održavanje potrebne temperature i pH vrednosti • sprečavanje intenzivnog penjenja podloge

11. UTICAJ RASTVORENOG CO2 NA RAST, SINTEZU CEFALOSPORINA C I MORFOLOGIJU ACREMONIUM CHRYSOGENUM • Visoke koncentracije rastvorenog CO2 dovode do: • smanjenja produkcije cefalosporina C i do 36 % • inhibicije metaboličke aktivnosti • dubokih promena u mikro i makromorfologiji A.chrysogenum • dCO2 je kontinualno meren tokom svih bioprocesa koristeći pouzdanu metodu sterilisane pare in situ. • Eksperimenti su vođeni na pH blizu neutralnog (pH 6.5)

12. 1. Uticaj povećane koncentracije dCO2 na biomasu Kontrolisani bioproces: u vremenu 0 prosečna biomasa je 2.4 g/l i postepeno se povećava do maksimuma od 37.8 g/l za 63 h. 5 % CO2: maksimalna koncentracija biomase bila je 35.8 g/l za 159 h, što je za 5 % manje nego u kontrolisanom bioprocesu. 10 % CO2: dolazi do povećanja maksimalne koncentracije biomase na 40.3 g/l za 159 h, što je za oko 6.6 % više u odnosu na kontrolisani bioproces. 15 % CO2: maksimalna koncentracija biomase 28.0 g/l za 111 h, što predstavlja 26 % smanjenje u odnosu na kontrolisani proces. 20 % CO2: maksimalna biomasa 23.7 g/l za 64 h, smanjenje od 37.3 % u odnosu na kontrolisani bioproces

13. 2. Uticaj dCO2 na korišćenje ugljenih hidrata Smanjenje koncentracije biomase, u bioprocesu sa povećanim koncentracijama CO2, praćeno je smanjenim sadržajem ugljenih hidrata, i inhibitornim metabolizmom A. chrysogenum.

14. 3. Uticaj dCO2 na morfologiju A.chrysogenum A. 50 h, 10% CO2 B. 74h, 10% CO2 D. 143h, 15% CO2 C. 168h, 10% CO2 Proizvodnja cefalosporina C povezana je sa diferencijacijom hifalnih fragmenata do jednoćelijskih artrospora.

15. STIMULACIJA PRODUKCIJE CEFALOSPORINA C U PRISUSTVU GLICEROLA • Dodatak glicerola povećava produkciju cefalosporina C i do 12 puta, time što stimuliše diferencijaciju ćelija. • Utiče na morfologiju ćelija. • Glicerol se sporije troši od glukoze i dolazi do manje kataboličke represije A.chrysogenum M35 (ᴏ), 2%; (Δ),4%; (□), 6% glicerola (●) 2% glukoze • Ograničavajući faktor: raspoloživost cisteina • Visok nivo cisteina velika količina cefalosporina C • Glicerol se tokom fermentacije može konvertovati u cistein.

16. Uticaj kombinovanih izvora C na produkciju cefalosporina C • 2% (v/v) glicerola (ᴏ) • 4%(v/v) glicerola( ) • glukoza bez dodatka glicerola ( ) • Podloga koja sadrži glukozu i 4% glicerola rezultuje visokim prinosom cefalosporina C. • Sinergistički efekat između glukoze i glicerola dovodi do poboljšanja produkcije cefalosporina C.

17. IZDVAJANJE I PREČIŠĆAVANJE ANTIBIOTIKA • Cilj je dobijanje preparata visokog stepena čistoće podesnog za upotrebu u medicini. • PRETHODNA OBRADA kojim se antibiotik prevodi u rastvorljiv oblik (vodena faza) ili u nerastvoran oblik (vezan za koloidnu fazu). • FILTRACIJA na rotacionim vakuum filtrima omogućava razdvajanje na tečnu fazu i biomasu. • IZDVAJANJE ANTIBIOTIKA IZ NATIVNOG RASTVORA (0,1-0,5 %) primenom T/T ekstrakcije, jonske izmene ili taloženjem. • UKLANJANJE PREOSTALIH OBOJENIH PRIMESA pomoću aktivnog uglja, kristalizacije, centrifugiranja, sušenja u struji toplog vazduha, sušenja u vakuumu...

18. HVALA NA PAŽNJI!