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第六章 植物基因克隆方法 ( 二 ). 张玉刚 zyg4458@163.com. 目的基因的分离. 构建文库法(基因组文库、 cDNA 文库、 SSH 文库等) 差示筛选法 (DDRT-PCR) 转座子标签法及 T-DNA 插入突变法 基因图谱的克隆法 分子标记 RACE 同源基因克隆 人工合成 PCR 电子克隆. 二、应用 PCR 扩增基因. PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法,有称之为体外扩增法。. RT-PCR DDRT-PCR RACE-PCR 等结合使用.
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第六章 植物基因克隆方法(二) 张玉刚 zyg4458@163.com
目的基因的分离 • 构建文库法(基因组文库、cDNA文库、 SSH文库等) • 差示筛选法 (DDRT-PCR) • 转座子标签法及T-DNA插入突变法 • 基因图谱的克隆法 • 分子标记 • RACE • 同源基因克隆 • 人工合成 • PCR • 电子克隆
二、应用PCR扩增基因 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。 RT-PCR DDRT-PCR RACE-PCR等结合使用
PCR (polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应 PCR、基因克隆、DNA序列分析几乎是现代分子生物学的实验工作基础。 Khorana等在1971年提出。 1985年Kary Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow 片断体外扩增b-globin ( Saiki,et al., Science, 230: 1350-1354) 1988年发现热稳定DNA聚合酶(Saiki,et al., Science, 239:487-491).
PCR技术 在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。
PCR反应的基本条件 • 热稳定DNA聚合酶 • 引物,为PCR反应中最关键的因素。标准PCR反应,每条引物的浓度为0.1-0.5umol/L,足够扩增1kb片断、少于30个循环的反应。引物浓度过高会引起错配。 • 脱氧核苷三磷酸,dATP, dTTP, dCTP, dGTP. 在Taq DNA聚合酶,含有1.5mM/l MgCl2 的条件下,每种dNTP的浓度范围为:200-250 uM/L.dNTP浓度过高(>4mM/L)对反应有抑制作用。dNTP原液的pH为8.1左右,碱性条件可防止dNTP结构的破坏。 • 二价阳离子。热稳定DNA聚合酶所必需的。通常为Mg2+。由于dNTP及引物可结合Mg2+,所以,反应体系中Mg2+的浓度必须高于dNTP及引物来源的磷酸盐的摩尔浓度。通常为1.5mM/L.
5.维持pH的缓冲液。一般为Tris-Cl,pH为8.3-8.8之间。Tris-Cl的浓度一般为10mM/L。在72℃时,反应液的pH下降大约一个单位,是反应液的pH为7.2左右。5.维持pH的缓冲液。一般为Tris-Cl,pH为8.3-8.8之间。Tris-Cl的浓度一般为10mM/L。在72℃时,反应液的pH下降大约一个单位,是反应液的pH为7.2左右。 6.一价阳离子。通常为50 mM/L KCl。较高的KCl浓度(70-100mM/L)对扩增较短的DNA片断有利。 7.模板DNA。如果各种PCR反应条件较佳,仅单拷贝的DNA模板也可被扩增。 酵母、细菌及质粒的典型反应量为10ng、1ng、1pg.
热稳定DNA聚合酶 Taq酶 Taq+Pfu Pfu 其他
PCR反应的设计 ---变性。不同的DNA聚合酶的要求不同。普通Taq酶的变性温度一般为94-95oC,30-45秒。PCR第一循环的变性时间一般为2-5分钟。当G+C含量高于55%时,变性时间需要延长。 ---引物和模板DNA的复性(退火)。该温度依据引物与模板的熔解温度而定,一般低于理论值的3-5度。 ---引物的延伸。Taq酶的最适温度为72-78℃,反应速率为2Kb/min。一般实验设计为1kb/min. 最后一个循环一般为5-10min.Pfu等高保真的DNA聚合酶,反应速率一般为1kb/min,实验设计为0.5kb/min. ---循环数目:根据反应条件,一般为25-40个循环反应不等。
靶DNA的扩增 5’ 3’ (a) 5’ 3’ (b) 引物2 3’ 5’ 引物1 引物2互补链 (c) 引物1互补链 3’ 5’ (d) 5’ 3’ 5’ 3’ (e) 3’ 5’ 新引物 不同长度的链 单位长度的链 (f) 引物1互补链 引物2互补链 目的片段(不同长度的链未示出) (g) 5’ 3’ 3’ 5’ 聚合酶链式反应示意图
循环1 循环2 循环3 温度(℃) 94℃变性(1min) 94 72 60 72 ℃延伸(1.5min) 60 ℃退火(1min) 时间(min) PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min, 60 ℃退火1min, 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
引物设计 ---G+C含量应在40-60%质坚,四种碱基要分配均匀。 ----长度为18-25bp, 上下游引物的长度差别不要大于3bp. ----重复和自身互补序列。不能有大与3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。 ----上下游引物的互补性。注意3’-末端不能和另一个引物结合,避免引物二聚体的形成。 ----解链温度。两个引物的Tm值相差不能大于5oC, ----3’-末端:最好有一个G或C。 ----5’-末端加限制性酶切点。不同的酶要求加保护核苷酸的数量不同。New England Biolabs 参考目录。
引物设计软件—Primer5.0 计算机辅助设计引物: http://www.idtdna.com 熔解温度的简便计算方法: Tm/oC=2(A+T)+4(G+C)
影响PCR反应的一些因素 -----引物 -----模板DNA的纯度 -----退火温度 -----注意试剂污染 -----非特异扩增 -----引物二聚体
PCR产物的克隆 ---PCR产物的纯化:PCR产物经酚:氯仿等常规方法纯化后,DNA样品中经常还残留Tag DNA聚合酶等,DNA聚合酶在以后的连接反应中可补平限制性内切酶所产生的3’-末端。这可能是许多实验室克隆PCR所遇到的困难。 蛋白酶k (最终浓度50ug/ml)处理可降解DNA聚合酶的干扰。
PCR产物的平端克隆 (分子克隆第三版 p625) 50 ug/ml 闭环质粒载体 1ul 25ug/ml PCR产物 8ul 10xKGB 广域缓冲液 2ul H2O 5ul 10mM/L ATP 1ul 2mM/L dNTP 1ul 限制性内切酶 2单位 T4DNA聚合酶 1单位 T4DNA连接酶 3单位 总共: 加水补充至 20ul 22oC, 4h 转化感受态细菌
Taq DNA聚合酶 PCR产物连入T载体 pBluescript SK 5ug Eco RV 30units 10Xbuffer 5ul H2O 50ul 37oC 3h T载体的制作: Phenol Chloroform Phenol/ Chloroform
EtOH,沉淀 离心 75%EtOH,洗 干燥 5ul 10XPCR buffer 1ul 100mM dTTP 0.5ul Taq polymerase H2O 72oC, 2 hr Phenol Phenol/ Chloroform Chloroform
EtOH,沉淀 离心 75%EtOH,洗 干燥 Add H2O to about 50ng/ul Ligation: T-vector 1ul PCR product 1ul (Don’t purify) T4 DNAligase 3units 10XLigation buffer 1ul H2O 10ul 16oC, >4hr
克隆带有酶切位点的PCR产物 引物加入酶切位点, 注意在引物设计时加保护碱基
应用PCR导入点突变位点 PCR Dpn1digestion 转化细菌
应用PCR导入点突变位点 及DNA序列的增加或删除 Stratagene,P113
三、根据同源基因进行克隆 • 1、RNA提取 • 2、cDNA合成 • 3、根据同源基因设计兼并引物(关键) • 4、PCR扩增 • 5、体外重组(克隆)
同源基因设计兼并引物 • 要同时参照氨基酸序列和核苷酸序列 根据同源基因进行克隆基因一般只能得到基因片段, 而不是全长,如果想得到全长,还要进行RACE
四、RACE 法克隆基因全长(Rapid Amplification of cDNA Ends) • 根据已知片段设计引物,RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。 • cDNA 5′端的快速扩增法 • cDNA 3′端的快速扩增法
5’RACE实验使用的主要试剂 • TaKaRa 5′ -Full RACE Core Set • TaKaRa LA Taq 酶 • 5条DNA扩增用引物 • 切胶回收试剂盒
5 ’ RACE原理 ●Self-Ligation 法
5’ RACE 的实验方法 • 反转录(RT)反应。 • Hybrid RNA的分解。 • 单链cDNA的自身连接。 • PCR扩增5’未知区域。 • 目的DNA片段的切胶回收。 • DNA序列测定。
实 验 例 (获取PSPtet RNA的5’末端) • 体外转录PSPtet RNA。 • 配制PSPtet RNA和人总RNA的混合样品。 • 设计合成5条引物。 • 使用5’ RACE法获取PSPtet RNA的5’末端。 • 切胶回收目的DNA片段。 • 进行DNA测序确认序列结果。
PSPtet RNA 体外转录
1 M 1 : Human Total RNA M :λHind III Marker 人总RNA的电泳结果
PSPtet RNA的5’端序列 AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT···········
五条引物与PSPtet RNA的位置关系图 未知 序列 5’ 3’
5条引物的详细序列 RT Primer: 5’-(p)AAAATGACCCAG- 3’ F1 Primer: 5’-GTCCTGTGGATCCTCTACGC- 3’ R1 Primer: 5’-AGCCACTATCGACTACGCGAT- 3’ F2 Primer: 5’-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG- 3’ R2 Primer: 5’-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA- 3’
Step1. 反转录反应 1.反应液组成: RNA Mixture 10×RT Buffer RNase Inhibitor (40 U/ml) AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/ml) 5’ 磷标记反转录引物(200 pmol/ml) RNase Free dH2O up to 3.0 mg 1.5 ml 0.5 ml 1.0 ml 1.0 ml 15 ml 2.反应条件: 30℃ 10 分钟→ 50℃ 30 分钟→ 80℃ 2 分钟→4℃ 保存
Step2. Hybrid RNA的分解 1.反应液组成: 1st Strand cDNA反应液 5×Hybrid RNA Degeneration Buffer RNase H (60 U/ml) dH2O up to 15 ml 15 ml 1 ml 75 ml 2.反应条件: 30℃; 1 小时→乙醇沉淀
Step3. 单链 cDNA 的自身连接反应 1.反应液组成: Step2 的 cDNA 沉淀物 5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer dH2O 40% PEG#6000 T4 RNA Ligase (40 U/ml) 8 ml 12 ml 20 ml 1 ml 2.反应条件: 16℃; 过夜反应
Step4. PCR 反应 (1st PCR) 1.反应液组成: 2.反应条件如下: Step3 的连接反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F1 (20 mM) Primer R1 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 3 min 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 25 Cycles
Step4. PCR 反应 (2nd PCR) 1.反应液组成: 2.反应条件如下: 1st PCR反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F2 (20 mM) Primer R2 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 30 Cycles
M 1 M : DL2000 Marker 1 :PCR产物 2nd PCR反应结果
1 M 1 :回收DNA片段 M :DL2000 Marker Step5. 目的 DNA 片段的切胶回收 ●切胶回收电泳结果如下
Adaptor-Adding Method 原理
讨 论 • 本实验成功获取了PSPtet RNA的5’ 末端。 • 在mRNA 3’ 末端部分序列已知的情况下,可使用 • TaKaRa 5’ RACE法有效获取其 5’ 末端序列。 • 3. 实验中注意以下环节,可提高实验成功率。 • 1)起始RNA的量与质量。 • 2)引物设计(●RT引物 ●特异性)。 • 3)5’ 末端未知序列的长度(尽量短)。
MxNas1 3’RACE 3’-RACE产物阳性克隆的PCR鉴定 M:DNA marker; 1和2: 3’-RACE阳性克隆的PCR产物; 3: 3’-RACE产物(正对照); 4: 空载体的PCR(负对照). 3’-RACE扩增结果 M: DNA Marker; 1: 3’-RACE扩增产物
MxNas1 5’RACE 5’-RACE扩增结果 M: DNA Marker; 1: 5’-RACE扩增产物 5’-RACE产物阳性克隆的PCR鉴定 M:DNA marker; 1: 5’-RACE产物(正对照); 2: 空载体的PCR(负对照); 3和4: 5’-RACE阳性克隆的PCR产物