TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

1. TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

2. UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO ... • Qualitativo: + ou – • Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída – a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320) • Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado. ? IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico

3. Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac • Afinidade • Avidez • Taxas Ag-Ac • Reações Cruzadas • Anticorpos: • Monoclonais • Policlonais

4. TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS • Técnicas sem uso de marcadores • Reações de Precipitação • Reações de Aglutinação • Técnicas com uso de marcadores • ELISA • Citometria de fluxo • Imunofluorescência • Radioimunoensaio

5. TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS • PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial • - Imunoeletroforese • AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação • - Teste de Coombs • IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA • - Imunofluorescência • - Citometria de Fluxo PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

6. SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO

7. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO ZONA DE EQUIVALÊNCIA EFEITO PRÓ - ZONA EFEITO PÓS - ZONA

8. IMUNODIFUSÃO DUPLA • Utiliza uma matriz de ágar • Ag + Ac = linha de precipitação visível Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)

9. Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ac Ac Ac • Coloca-se agarose sobre uma lâmina: • As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação • Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes

10. Ac no gel Ag Ag Ag Ag Diameter2 Ag Concentração IMUNODIFUSÃO RADIAL • Método de Mancini • Anticorpo no gel • Antígeno no poço • Vice-versa • Interpretação • Diâmetro do anel é proporcional à concentração do Ag

11. IMUNODIFUSÃO RADIAL • Fácil, baixo custo • Utiliza uma matriz de ágar • É quantitativa Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas

12. 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na canaleta Ag canaleta + - Ag 3- Difusão e precipitação 2- Anti-soro na coluna canaleta IMUNOELETROFORESE • Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. • As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. • Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. • Ag e Ac formam arcos de precipitação. • É qualitativo • Utiliza lâminas recobertas com ágar Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia

13. IMUNOELETROFORESE

14. REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO • Pode ser direta ou indireta • + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartículas amplificam a reação • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) Eritrócitos Bactérias Fungos látex Agregação visível de partículas • USO: • Tipagem ABO • Testes confirmatórios para sífilis, FR

15. AGLUTINAÇÃO DIRETA Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais na sua superfície + Ac = Aglutinação Hemácias Bactérias Protozoários Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 1) Amostra de sangue na placa teste: 3) Controle negativo: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 4) Mistura-se:

16. AGLUTINAÇÃO DIRETA negativo positivo 5) Leitura do resultado: Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);

17. AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Agssolúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi(ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. • O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. • Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglut + Aglut -

18. AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE • Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também AcsIgA e IgG. Enfermidades em que o encontro de FR é comum • Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho) • Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade

19. TESTE DE COOMBS (Antiglobulina) • DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos • INDIRETO:Detecta Ac anti-eritrócitos no soro • 1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh). • 2.R. medicamentosa • 3.R. transfusional

20. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel. • Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG. • Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre • aglutinação.

21. IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica: • Anticorpos ou antígenos são conjugados a umfluorocromo,que, quando excitadopor radiações UV, emite luz no espectro visível. • A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em ummicroscópio de fluorescência • Principais fluorocromos:fluoresceína(isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametilrodamina – TRICT). IFA direta: • Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele. IFA indireta: • pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)

22. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

25. Treponema pallidum Tripanosoma cruzi Pneumocystis carinii Giardia lamblia

26. CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento ) • Separação de células marcadas por fluorescência; • Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) • Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. • É um teste qualitativo e quantitativo. • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. CD 18 CD 4 CD 125 CD 147

27. CITÔMETRO DE FLUXO • SISTEMA FLUIDO:INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO • SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. • SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

28. CD4 CD8 CD20

29. USO • Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas • Isolar populações celulares • Quantidade, tamanho, granulosidade; • Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags • Tamanho celular.

30. APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO - Análise da subpopulaçãolinfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Análise de reticulócitos - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Quantificação de células progenitoras (Stemcells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado

31. Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA • O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. • O produto final ação daenzima sobre o substrato = COR • Produtofinal coradoleitura em fotocolorímetro. • Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. • Direto = Ag • Indireto = Ac Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estáveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -Não trabalha com radioisótopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação -Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.

32. Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA INDIRETO DIRETO OU SANDUÍCHE Ac marcados com Enzimas + substrato = COR + Ag • Qualitativos • Quantitativos Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

34. Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

37. ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?

38. CURVA PADRÃO - ELISA

39. RADIOIMUNOENSAIO - RIA • Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131) • Marcações: • I125: emite raios gama • H3: raios beta • Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.

40. RADIOIMUNOENSAIO

41. RADIOIMUNOENSAIO • Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc. • • Vantagens: • – Alta sensibilidade • – Permite medidas rápidas e precisas • – Limiar de detecção em nanogramas e picogramas. • • Desvantagens: • – Custo • – Vida média dos reagentes • – Risco operacional (radiação)