Václav Řehout

1. Geneticky manipulované organizmy teorie, praxe, etika, rizika a legislativa Václav Řehout Zemědělská fakulta Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Projekt FRVŠ 3556/2005.

2. Definice GMO biologická Pojem GMO zahrnuje takové organizmy, jejichž genetický základ byl úmyslně pozměněn vnesením či vyjmutím nějakého genu (genů). Definice GMO legislativní GMO je organizmus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací.

3. Genové inženýrství (GI) = techniky vedoucí k umělé tvorbě geneticky pozměněných buněk nebo celých organizmů zásahem do jejich DNA výsledkem vznik nových modifikovaných genomů, transgenních organizmů, které by se za normálních okolností v přírodě nemohly vyskytnout

4. Cílem jsou v podstatě dva procesy: • vložení cizího DNA segmentu (genu, konstruktu) do • DNA příjemce • vyřazení nežádoucího genu z funkce, tzv. genový • knock-out

5. Techniky GI • identifikace a izolace genů, • získání genového konstruktu • volba příjemce pro přenos • genového konstruktu • volba metody pro přenos • genového konstruktu

6. Konstrukce transgenu a tvorba rekombinantní DNA

7. Konstrukce transgenu - modifikace izolovaného genu podmínka pro úspěšnou integraci a expresi genu Sekvence promotoru - přidána k transgenu z důvodu správné exprese genu (tzn. překlad do proteinového produktu) Terminační sekvence - signalizuje buňce zakončení sekvence genu Markergen- přidán z důvodu identifikace úspěšného včlenění transgenu

8. Tvorba rekombinantní DNA (rDNA) rDNA je uměle vytvořená DNA. DNA z několika zdrojů je včleněna do jedné rekombinantní molekuly DNA.

9. Namnožení cílových DNA fragmentů

10. Namnožení molekuly DNA Molekulární klonování získání identických kopií cílového transgenu nebo rDNA Molekulární klonování in vitro - procesem polymerázové řetězové reakce (PCR) Molekulární klonování in vivo - pomocí prokaryot (bakterie, např. E. coli), - pomocí eukaryot (kvasinky), - pomocí buněk savců rostoucích v tkáňových kulturách.

11. Molekulární klonování in vitro Polymerázová řetězová reakce (PCR) = enzymatické namnožení (amplifikace) DNA syntézou mnoha kopiií vybrané sekvence DNA • cyklická reakce o třech teplotních fázích: • Denaturace: dvouvláknová DNA denaturována na dvě • jednovláknové templátové molekuly DNA • Annealing: nasedání oligonukleotidových sond (primerů) • na obou stranách cílové DNA • Elongace: syntéza nových vláken pomocí termostabilní • DNA polymerázy od 5´konce ke 3´konci • začínající od primerů

12. Schéma PCR v každém cyklu se množství DNA zdvojnásobí exponenciální amplifikace z každé molekuly původního templátu bude vytvořeno 2n kopií, kde n je počet cyklů 30 cyklů = 1010 násobné namnožení DNA

13. Molekulární klonování in vivo = namnožení určitých fragmentů DNA pomocí vektorů vektor= molekula, která obsahuje všechny sekvence potřebné ke vstupu, přežití a množení v určité hostitelské buňce klonovací vektor = slouží nejen k přenesení do buňky, ale i k zajištění jejího klonování v buňce 

14. Klonovací vektory Plazmidy malé molekuly kruhové DNA v bakteriálních buňkách Fasmidy plazmidy vybavené navíc částí genomu bakteriofága Bakteriofágy viry napadající bakterie Kosmidy plazmidy se zabudovanými částmi sekvence bakteriofága  Umělé bakteriální chromozómy (BAC-bacterial artificial chromosome) Umělé kvasinkové chromozómy (YAC-yeast artificial chromosome)

15. Inzerce DNA do plazmidu

16. Postup: • volba tzv. kompetentní buňky, schopné přijmout cizí DNA • destabilizace cytoplazmatické membrány (mírný tepelný šok, vápníkové ionty apod.) • kultivace v podmínkách zajišťujících tvorbu propustné buněčné stěny a zvýhodňujících udržování a množení plazmidu Transformace DNA do bakterie Transformace =proces, kterým je molekula DNA vpravena do buňky

17. Schéma bakteriální transformace Úspěšnost transformace cizí DNA je sledována na základě marker genů, které danou buněčnou kolonii odlišují na kultivačním mediu od kolonií bez přenesené DNA. Marker geny: pro rezistenci vůči antibiotiku; pro alfa-peptid enzymu -galaktosidázy zajišťující barevnou odlišnost kolonií atd.

18. Klonování DNA pomocí bakteriálního plazmidu

19. Izolace klonované DNA • oddělení klonované DNA od DNA a proteinů bakterie •  lyzační metoda • volná plazmidová (rekombinantní) DNA musí být dále • purifikována centrifugací na cesium chloridovém gradientu • a cílový fragment rDNA vyštěpen z vektoru restrikčními enzymy

20. plazmid DNA Komerční kity založené na chromatografické technologii tento proces zjednodušují. Purifikace DNA cesium chloridovým gradientem Roztok plazmidové DNA je smíchán s ethidium bromidem pro vizualizaci v UV světle. Vrstvy plazmidové DNA jsou poté odsáty jehlou injekční stříkačky přes stěnu centrifugační zkumavky.

21. Plazmidová DNA je vystavena působení restrikční endonukleázy 1  vyštěpení rekombinantní DNA z vektoru 2 1 – horní band představuje plazmidovou DNA – vektor 2 – dolní band představuje rekombinantní DNA uvolněnou z vektoru Uvolnění rDNA z vektoru

22. Příprava transgenních organizmů

23. Příprava GM rostlin Příprava GM živočichů

24. Příprava GMO Technologie tvorby • technicky i časově náročný proces • využití poznatků molekulární biologie, využití metod • genetického a buněčného inženýrství • poznatky integrovány do moderních šlechtitelských • postupů

25. Příprava GM rostlin Schéma tvorby GM rostlin • výběr genu(ů) pro dosažení požadované vlastnosti • izolace vhodného genu(ů) a klonování genu v baktérii • úpravy genu(ů) • transformace genu(ů) do genomu rostliny • selekce transformovaných rostlin • sledování projevu transgenu • testy v uzavřených prostorách laboratoří a skleníků • vyhodnocení biologické bezpečnosti • polní zkoušky transgenních rostlin • hodnocení biologické bezpečnosti • registrační zkoušky GM odrůdy

26. Metody transformace transgenu Existuje řada metod, kterými je docílena transformace transgenní DNA do rostlinných buněk. Nejčastěji využívanými: - transformace s využitím bakterií - přímá transformace

27. Transformace s využitím bakterií Půdní bakterie: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes • vyvolávají růstové a genetické změny u napadených rostlin • přenáší část svých genů z Ti (tumor-inducing) plazmidu do rostlinnéhogenomu

28. Příprava GM rostlin s využitím bakterií

29. - rostlinný materiál: • jádra nebo organely kultivovaných buněk • rostlinné orgány Přímá transformace = přímý přenos klonované DNA mikroprojektilové ostřelování rostlinného materiálu (microparticule bombardment, biolistic transformation) • vstřelování mikroskopických částic netoxických kovů, na jejichž povrchu je přichycena DNA

30. wolfram zlato Mikroprojektilová pistole Mikroskopické částice

31. Příprava GM rostlin přímou transformací

32. Výběr úspěšně transformovaných tkání Transformované rostlinné tkáně jsou přemístěny na medium obsahující antibiotikum či herbicid, podle toho, jaký selektivní marker byl použit.  přežívají pouze rostlinky exprimující vybraný marker gen a vložený transgenní konstrukt

33. Počáteční hodnocení zaměřují pozornost na: • aktivitu vloženého genu • stabilita dědičnosti • vlivy na růst, produkci a kvalitu Transgenní rostlinky jsou pěstovány v kontrolovaných životních podmínkách na médiích obsahujících potřebné živiny a hormony. Rozsáhlá hodnocení a testace transgenních rostlin ověřují, zda začlenění genu je stabilní a bez škodlivých vlivů na další funkce rostlin, kvalitu produkce a agroekosystém.

34. Nejčastěji využívané transgeny Geny významné z hlediska zemědělských a potravinářských technologií • geny podmiňující odolnost vůči herbicidům • geny podmiňující odolnost vůči hmyzím škůdcům • geny podmiňující odolnost vůči houbovým patogenům • geny podmiňující odolnost vůči virům • geny podmiňující odolnost vůči antibiotikům • geny zvyšující nutriční hodnotu • geny umožňující nové technologické postupy v rostl. výrobě (pylová sterilita – produkce F1 hybridů; terminátor)

35. Geny pro produkci farmaceuticky využitelných látek Geny pro průmyslové aplikace a zpracování suroviny • změněný obsah a kvalita lipidů • změněný obsah a kvalita škrobu • produkce enzymů pro potravinářský a papírenský průmysl • produkce biodegradovatelných polymerů

36. Příprava GM zvířat Cílem přenosu genového konstruktu: • časné stadium vývinu embrya na úrovni 1 buňky (zygoty) před splynutím prvojader • linie pluripotentních buněk

37. Metody transformace transgenu Přenos genového konstruktu je realizován různými metodami závisejícími na: • druhu organizmu • buněčném typu • zaměření transformace nebo transgenózy

38. Mikroinjekce • požadovaný gen je přenesen do vajíčka těsně po • jeho oplození (zygota) • provedení pomocí mikromanipulátoru pod kontrolou • mikroskopu, injekcí o velikosti 2 – 5 pikolitrů - proces začlenění je náhodný • počet začleněných kopií je nekontrolovatelný od malého • počtu do stovek kopií původního konstruktu - účinnost začlenění konstruktu 1:1000

39. Mikroinjekce Extrémně tenkou jehlou je do samčího prvojádra vpraveno nepatrné množství roztoku obsahující mnoho kopií transgenu. Zygota je pevně přichycena pipetou.

40. superovulace a oplození izolace buněk (zygot) mikroinjekce transgenu transfer vajíček do náhradnic Schéma metody mikroinjekce

41. Transformace embryonálních kmenových buněk • metoda využívaná k přenosu cílové genové sekvence • na specifické místo v genomu Příprava embryonálních kmenových buněk • během kultivace buněk je přidán vhodný vektor, • který zajistí specifickou genetickou modifikaci (např. • odstranění nebo vložení vybraného genu, nebo dokonce • výměnu jednotlivých bází v genetickém kódu)

42. Schéma transformace kmenových buněk Výsledný jedinec je chimérou. Testace potomstva na přítomnost vloženého genu. Páření heterozygotních jedinců s cílem získat homozygotní transgenní linii.

43. Použití retrovirových vektorů • využití schopnosti retrovirů proniknout a začlenit svou genetickou • informaci do jádra hostitelské buňky • zabudování genového konstruktu do viru tak, aby byla zachována • schopnost množení a vnesení genetické informace do buňky • odstranění části genomu viru zodpovědné za zničení hostitelské • buňky • přednost: zabudování pouze jedné kopie • omezení: velikost délky přenášených konstruktů (max. 10 kb) • obavy: schopnost virů navodit nádorové bujení, obnovení jeho • patogenity

44. Klonování organizmů - technika používaná k vytvoření identických organizmů Reprodukční klonování - vytvoření duplikátu(ů) existujícího jedince Terapeutické klonování - strategie buněčné terapie

45. Reprodukční klonování - dvě techniky: přenos jádra zárodečné buňky přenos jádra somatické buňky

46. Cíle živočišného reprodukčního klonování: • produkce hospodářských zvířat (zlepšení kvality zvířat • či jejich produktů) • produkce GM laboratorních zvířat (studium lidských chorob, • testace nových léků) • produkce GM hospodářských zvířat (produkce vysoce • terapeutických proteinů) • pokus záchrany ohrožených či vyhynulých druhů • zlepšení klonovaných domácích zvířat • - produkce živočichů vhodných pro xenotransplantace

47. Přenos jádra zárodečné buňky - 3 hlavní kroky: • získání oocytu hormonální stimulace ovce za účelem získání velkého množství zralých oocytů • získání DNA umělá inseminace ovce spermatem berana za účelem získání embrya (16 nebo 32 buňkové stadium), vyjmutí zárodečné buňky • implantace vložení zárodečné buňky do oocytu, získání blastocysty in vitro, implantace do dělohy náhradní matky

48. Foto: Odstranění jádra Obr.: Embryo Foto: Vyjmutí embryonální buňky Foto: Blastocysta Získání oocytů výplachem dělohy, jejich přečištění a následné odstranění jádra pomocí mikropipety. Získání embrya výplachem dělohy, jeho přečištění a následné vyjmutí embryonální buňky pomocí miniaturních kleští. Růst oocytu do stadia blastocysty in vitro.

49. Schéma přenosu jádra zárodečné buňky

50. Přenos jádra somatické buňky - 3 hlavní kroky: • získání oocytu hormonální stimulace ovce za účelem získání velkého množství zralých oocytů • získání DNA odebrání somatické buňky z vemene ovce, kultivace buněk a docílení klidové fáze G0 buněčného cyklu • implantace vložení jádra somatické buňky do oocytu, získání blastocysty in vitro, implantace do dělohy náhradní matky