Chapter 9 基因操作 （ 中国医科大学医学遗传学教研室 ）

1. Chapter 9 基因操作（中国医科大学医学遗传学教研室 ） 第一节、重组DNA技术---基因工程 第二节、基因文库 第三节、分子杂交及相关技术 第四节、DNA多态

2. 第九章 重点内容提示 • 基因操作，重组DNA技术,原理,步骤 • 限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端，粘末端） • 基因载体（vector）,条件，常用载体 • 基因探针，来源 • 克隆(clone) • 探针标记方法:nick translation (缺口平移)、随机引物法 • DNA多态，RFLP ，VNTR，STR ，微卫星DNA • PCR 方法、原理、应用 • Southern –Blot:方法、原理、应用 • Northern-Blot：方法、原理、应用

3. Chapter 9 基因操作 • 70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。

4. 1996酵母基因组序列 1956HbsGlu-Val 1972重组质粒 1986位置克隆 1944DNA是遗传物质 第一个R酶 1983HD病G定位 1970 1975 1980 1985 1990 1995 1946 1950 1955 1960 1965 1949Hbs贫血 1966遗传密码 1953双螺旋 1975DNA杂交 现代分子遗传学发展 重要事件 1977DNA测序 1981转G小鼠 1985PCR 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列

5. 第一节重组DNA技术---基因工程 • 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 • 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 • 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。

6. 一、限制酶 • 限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”） • 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

7. 1、限制酶的命名 • 根据其来源命名。如： 属名菌株名 E co R I 种名编号 • EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。

8. 2、限制酶识别序列和切割形式 • 每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。 如：Hare III 5’-GGCC- 3’   3’-CCGG- 5’ Bam HI 5’-GGATCC-3` 3’-CCTAGG- 5’ 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形式 粘性末端（sticky end）交错切

10. 5’ － G G 3’ － C C C C － 3’ G G － 5’ 5’ － G A T C－ 3’ － 5’ 5’ － 3’ － C T A G－ 5’ 5’ － G A T CC － 3’ G － 5’ 5’ － G 3’ － CC T A G－ 5’ 5’ － C T G C A－ 3’ 3’ － G G － 3’ 3’ － A C G T C － 5’ 限制性内切核酸酶 5’ － G G C C － 3’ 3’ － C C G G － 5’ HaeⅢ 5’ － G A T C － 3’ 3’ － C T A G － 5’ MboⅠ 5’ － G G A T C C － 3’ 3’ － C C T A G G － 5’ BamHⅠ 5’ － C T G C A G － 3’ 3’ － G A C G T C － 5’ PstⅠ

11. 互补末端连接

13. 产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式： • 1)用同一种限制酶切割； • 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； • 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。

14. 3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： • 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 • 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 • Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

15. 二、基因运载体及其选择 • 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

16. 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 • 常用的载体：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。

17. （一）质粒 plasmid  Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 PBR322 大肠杆菌 pSC101  Plasmid chromosome  COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母质粒

18. 常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。 EcoRI HindIII LacZ pUC19 Ori复制起点 APR

19. （二）.λ-噬菌体(λphage) • 是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装37~52kb DNA分子. • 改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：

20. 置换λ载体– 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 • 插入载体– 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。

21. 裂解途径

22. （三）.粘粒(cosmid vector)（30~50kb） 是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid –而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30~50 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

23. (四) 大片段DNA克隆载体 • 人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。

24. 1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） • 优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 • 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。 • 为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受>300kbDNA片段。

25. 2、噬菌体PI载体和PAC • PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110~115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。 • 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。

26. 3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC） • 适用于克隆大片段DNA，0.2~2Mb。

28. YAC 的主要功能成份有三： 着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 • 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。

29. 三、DNA重组与分子克隆化 • 为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。

30. 基本原理与过程： • 1、构建重组DNA：分离纯化目的基因 目的基因+ vector =重组DNA分子 • 2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 • 3、细胞克隆的筛选: 筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞至于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 • 4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。

31. 分离纯化目的基因目的基因+ vector =重组DNA分子

32. foreign DNA bacterial cell vector restriction endonuclease 重组DNA技术流程简图

33. foreign DNA bacterial cell host vector restriction endonuclease ligase 重组DNA技术流程简图

34. 重组DNA 和 分子 克隆

35. 重组DNA和分子克隆的几种方法： • 1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆； • 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 • 3、化学合成目的基因进行克隆 • 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆

36. 筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone）

37. 筛查含有目的基因的细胞克隆

38. 从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

40. 四、目的基因表达 • 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 • 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。 • 就是将目的基因与表达载体重组(含激动子)，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆（expression cloning）.

41. 目的基因表达

42. （一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达 • 原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。 • 通常采用大肠杆菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列）； 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征： 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2）活性受限或无活性。

43. (二)、真核细胞基因在真核细胞中表达 • 真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。 • 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。 • 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。

44. 第二节、基因文库 • 基因文库（gene library） 应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的克隆。

45. 一、 构建 基因 组 DNA文库

46. Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage λ vector

47. 二、染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library） 单个染色体: 细胞克隆 （流式C仪） ↓ 细胞 染色体 染色体文库 染色体区带: 区带特异 （显微切割 ） ↓ DNA文库

48. 三、cDNA文库（cDNA library） cDNA文 库构建： 特定组织 细胞一定 发育阶段 总mRNA

49. 第三节分子杂交及相关技术 分子杂交（molecular hybridization）,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。

50. 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链