590 likes | 715 Views
Fundamentos de los Análisis Inmunoradioquímicos (AIRQ). Dra. Patricia Oliver Área Radiofarmacia CIN - Facultad de Ciencias. Análisis basados en reacción Ag-Ac o ligando-receptor. Clasificación REACTIVO ESPECIFICO TRAZADOR Anticuerpo Receptor
E N D
Fundamentos de los Análisis Inmunoradioquímicos(AIRQ) Dra. Patricia Oliver Área Radiofarmacia CIN - Facultad de Ciencias
Análisis basados en reacción Ag-Ac o ligando-receptor Clasificación REACTIVO ESPECIFICO TRAZADORAnticuerpo Receptor RadionucleidoRIA RRA IRMA EnzimaEIA ERA CromógenoLIA Quimioluminiscencia QIA
Análisis inmunoradioquímicos Técnicas analíticas cuantitativas o semicuantitativasde amplia aplicación en medicina, veterinaria, así como en I&D. Son utilizadas para dosificar o detectar sustancias (analitos) presentes en pequeñas concentraciones en distintos fluídos biológicos u otras muestras.
Análisis inmunoradioquímicos Tipos RIA Radioinmunoanálisis Ac + Ag + Ag* Ac-Ag + Ac-Ag* + Ag + Ag* IRMA Análisis inmunoradiométrico FS-Ac + Ag + Ac’* FS-Ac-Ag-Ac’* RRA Análisis de radio-receptor R + L + L* R-L + R-L* + L + L*
RIA Método en el que el analito (Ag no marcado) presente en cantidad variable y el radiotrazador (Ag* marcado) presente en cantidad fija compiten por los sitios de unión del anticuerpo que se halla en cantidad limitada
RIA Ag + Ac AgAc Ag + Ac AgAc + Ag Ag*+ Ac Ag*Ac + Ag* Respuesta inversamente proporcional a [Ag]
RIAEl antígeno marcado compite con el antígeno frío por su unión al anticuerpo limitado
Ventajas del RIA Alta especificidad Alta sensibilidad 10-9 - 10-12g Manipulación sencilla Detección simple Volumen muestra 10-100 mL
Desventajas del RIA Posibilidad de reacción cruzada Pérdida de inmunoreactividad por daño por marcación
Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación
Trazador Pureza elevada Inmunoreactividad Actividad específica alta Radionucleidos 125I, 3H
125I T1/2 60 días Eg 35 keV Eff conteo 70 %
125I-Ag Desventajas Modificación química para esteroides Estabilidad no mayor de 60 d Precauciones por radiación g
125I-Ag Métodos de marcación Cloramina-T Lactoperoxidasa Bolton-Hunter Iodogen
Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación
Anticuerpo Determina Sensibilidad Especificidad Precisión
Anticuerpo Características Título Afinidad Reacción cruzada
Título Dilución del anticuerpo que se satura con el 50% del trazador Dilución óptima: es la que da la mejor relación entre estándar alto, medio y bajo
Afinidad k1 Ag + Ac AgAc k2 v1= k1[Ag] [Ac] v2= k2[AgAc] En el equilibrio v1= v2 entonces Ka=k1/k2= [AgAc]/[Ag] [Ac] Ka~ 1010 - 1013 M-1
Especificidad 1. Progesterona 2. 17b Estradiol 3. Pregnanodiol 4. Cortisol 5. 11-deoxicortisol 6. Testosterona 7. Pregnenolona 8. Corticosterona 9. 17a-OH-progesterona 10. 11-OH-progesterona 11. 11-deoxicorticosterona 12. 5b-pregnan-3,20-diona 13. 11a-OH-progesterona 14. 5a-pregnan-3,20-diona
Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación
Estándar • Niveles de concentración del analito exactamente conocidos • Matriz análoga a las muestras • Procesamiento idéntico a las muestras problema • Determina la exactitud del RIA
Obtención del estándar • Síntesis • Extracción a partir de órganos o tejidos • Ingeniería genética • Calibración con estándares de referencia internacional
Requerimientos del estándar • Identidad con el analito • Reproducibilidad • Estabilidad • Pureza elevada • Especie molecular única o libre de interferencias
Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación
Método de separación Rápido Sencillo Económico Reproducible No alterar equilibrio
Clasificación Adsorción Precipitación Fase sólida
Adsorción Carbón activado (Norit A) Carbón - dextrano Resinas intercambio iónico Silicatos Medición de AgAc en el sobrenadante
Precipitación 2º Anticuerpo (antigamaglobulina) Sulfato de amonio Solventes orgánicos (EtOH, PEG) TCA Proteína A Medición de AgAc en el precipitado
Fase sólida El anticuerpo o ligando está unido a un polímero insoluble No requieren centrifugación Esferas de sephadex o látex Partículas magnéticas Discos de celulosa Pared del tubo
Procesamiento de datos Gráficos Métodos de ajuste
Métodos de ajuste Interpolación lineal y = a+bx Interpolación spline y = a+bx+cx2+dx3 Regresión lineal y = a+bx Regresión polinomial y = a+bx+cx2+dx3 Ecuación logísticay = (a-d) + d 1+(x/c)b y = (a-d) + d [1+(x/c)b]m y=respuesta, a=Bo, b=pendiente, c=ED50, d=NSB, x= conc., m=factor de asimetría
IRMA Relación directa entre la concentración del analito a cuantificar y la respuesta del sistema analítico.
IRMA Actividad unida a la fase sólida es la fracción unida del sistema. Actividad unida al complejo representa la relación directa con la concentración del analito a cuantificar.
IRMA Anticuerpos monoclonales Introducción de plásticos con propiedades adherentes de inmunoglobulinas o moléculas grandes
IRMA Comparación con RIA Unión de todo el analito presente Sensibilidad teóricamente infinita Especificidad: analito reconocido por dos paratopos Reproducibilidad (tecnología en fase sólida) ~ al RIA Limitación en el caso de moléculas pequeñas que pueden no disponer de diferentes paratopos que puedan ser reconocidos por diferentes anticuerpos
IRMA El empleo de exceso de anticuerpo acelera las reacciones y se alcanza el equilibrio en menos tiempo
Control de calidad Credibilidad al sistema analítico Credibilidad de cada etapa involucrada directa o indirectamente con el sistema analítico Proceso por el cual el laboratorio observa sus propios análisis