Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008

1. Enhancing nuclear receptor-inducedtranscriptionrequires nuclear motor and LSD1-dependent genenetworking in interchromatin granules Qidong Hu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008

2. Arquitectura del núcleo y regulación de la transcripción Estudios previos demostraron que existen muchos sitios de unión a factores de transcripción en zonas intergénicas, algunos de ellos enhancers Pregunta: ¿cómo se comunican estos sitios con los genes blanco que regulan a través de largas distancias intra e inter-cromosómicas? Esto lleva a un estudio más profundo de la arquitectura nuclear y los territorios ocupados por los cromosomas

3. Territorios nucleares y el papel de la miosina-I • El núcleo está organizado en compartimientos. En algunos de estos compartimientos • Se encuentran los cromosomas (territorios cromosómicos) • Actualmente se cree que en la periferia del núcleo se encuentra el DNA inactivo • (heterocromatina), mientras que el DNA transcripcionalmente activo está cerca del • centro • Los cromosomas son capaces de cambiar de territorio al momento de transcribirse Se ha demostrado que la miosina-I (asociada a la polimerización de actina) está involucrada en el movimiento activo de los cromosomas a través de los distintos territorios del núcleo

4. Territorios nucleares y el papel de la miosina-I Un modelo propuesto:

5. Fábricas de transcripción Sitios discretos dentro del núcleo donde se lleva a cabo la transcripción: colocalización de RNA pol II y RNA naciente

6. Receptor nuclear ER-α ER-α: factor de transcripción activado por la unión con 17β-estradiol (E2) Asociado a la aparición y desarrollo del cáncer de mama AF-1: dominio de activación DBD: dominio de unión al DNA LBD: dominio de unión al ligando

7. Demetilasa de lisinas de histonas (LSD1) Estudios previos confirmaron que LSD1 es esencial para la activación de genes dependientes de E2 LSD1 es reclutada por ER-α unida a ligando y quita los metilos de las lisinas 4 y 9 de la histona H3, permitiendo que se active la transcripción  LSD1 ayuda a prevenir que receptores no unidos a ligando activen la transcripción de sus genes blanco en forma constitutiva

8. Objetivo: Analizar las interacciones intercromosómicas entre 2 genes (TFF1 y GREB1) ante la presencia o ausencia de estímulo con E2 y su relación con LSD1 y proteínas motor como la miosina-I nuclear

9. Métodos Tipos celulares: MCF7: células tumorales provenientes de tejido mamario HMEC: células del epitelio mamario (no tumorales) Identificación de interacciones: Ensayo “3D”: ensayo 3C acoplado a ChIP-DSL Visualización de las colocalizaciones: 2D y 3D-FISH: hibridación con sondas específicas fluorescentes

10. Métodos Tecnología 3C:

11. Métodos ChIP-DSL: DSL: DNA Selection and Ligation ·Se inmunoprecipita la cromatina conteniendo la proteína de interés (en este caso ER-α) ·Se revierte C-L y se biotinila la cromatina ·Hibridación con un pool de oligonucleótidos con primers en los extremos ·Selección en fase sólida y posterior ligación de los oligos con Taq ligasa ·Amplificación por PCR a partir de los primers y adición de los fluoróforos ·Hibridación en array

12. Métodos Tecnología “3D”: DSL

13. Resultados 1) Identificación de interacciones intercromosomicas inducidas por estrógeno Gen TFF1 (cromosoma 21): se sabía que estaba regulado por E2 Se realiza 3D para buscar interacciones entre TFF1 y 6 intervalos en cromosomas diferentes, uno de ellos GREB1, gen localizado en el cromosoma 2 e inducido por ER-α Resultado: de los 6 intervalos testeados, sólo GREB1 mostró señal  GREB1 interacciona con TFF1

14. Resultados FISH: analizar las interacciones entre TFF1 y GREB1 en presencia y ausencia de E2 Resultado: Inducción de 60 minutos con E2 favorece la colocalización de GREB1 con TFF1 (aproximadamente la mitad son interacciones bi-alélicas para ambos tipos celulares)

15. Control:

16. ¿Las interacciones intercromosómicas se dan solamente por la formación de loops en el DNA o están acompañados por movimiento de cromosomas?  Chromosome painting MCF7 HMEC Resultado: Luego de la inducción con E2 los cromosomas se presentan asociados.  Reorganización drástica de la arquitectura del núcleo Solamente hay interacciones crom. 2-crom. 21, pero nunca crom. 2-crom. 2 o crom. 21-crom. 21

17. 2) Requerimientos para las interacciones intercromosómicas dependientes de ERa Microinyección nuclear de siRNA contra ERa Tratamiento es efectivo para bloquear las interacciones entre TFF1 y GREB1 inducibles con E2 Interacciones TFF1:GREB1 dependen de la unión al ERa

18. Microinyección nuclear de siRNAs o anticuerpos anti-coactivadores de ERa La inactivación de ambos impide que se produzcan interacciones entre TFF1:GREB1

19. Microinyección nuclear de siRNA contra LSD1 LSD1 demostró ser esencial en la activación de los genes dependientes de E2 Las interacciones intercromosomicas inducidas por E2 se producen previamente a la activación de los genes.

20. ¿Las interacciones intercromosomicas dependen de la dinámica de la reorganización nuclear? Rol de la actina nuclear • Si bien no hay filamentos de actina en el núcleo, se sabe que la actina nuclear se encuentra presente en varios complejos transcripcionales y juega un rol importante en la activación transcripcional en levaduras. • Realizan microinyección nuclear de IgG anti-actina nuclear (2G2) en células epiteliales mamarias, antes y después del tratamiento con E2. Detectan oligomerización de g-actina en el núcleo en ambos casos. • Analizan el efecto que se produce en células epiteliales de mama, estimuladas con E2, al tratarlas con drogas que impiden la polimerización/despolimerización de actina.

21. Al interrumpir la polimerización de actina (latrunculina), y también al prevenir su despolimerización (jasplakinolida), hay una pérdida total de las interacciones intrercromosómicas inducidas por E2

22. Tanto latrunculina como jasplakinolida previenen la expresión inducida por E2 de 3 genes target de ERa (TFF1, GREB1, TMPRSS3). En células MCF7 las drogas tienen el mismo efecto: se produce una disminución en la expresión de TFF1 y GREB1 pero no se ve afectada la expresión de genes constitutivos (b-actina)

23. Cuando se realiza la microinyección de IgG anti- g-actina tampoco se producen las interacciones TFF1:GREB1 CONCLUSIÓN: La actina nuclear es requerida para que se produzcan las interacciones intercromosómicas analizadas, y además su dinámica es requerida para que se produzca la expresión de los genes inducidos por E2

24. Microinyección nuclear de siRNA e IgG anti-NMI Rol de la maquinaria de miosina Existe un requerimiento funcional directo de NMI en el núcleo. Los efectos producidos no se deberían a un efecto indirecto causado por la disrupción del citoesqueleto

25. Participación de motores nucleares basados en NMI En células microinyectadas con IgG anti-NMI se inyectaron plásmidos que expresaban NMI WT o mutantes de NMI que contenían mutaciones específicas en la cabeza de miosina-1: • R353C: no puede unir actina • S397L: carece de actividad ATPasa Las interacciones intercromosómicas que fueron bloqueadas con IgG anti-NMI pueden ser restauradas mediante la expresión de un vector que contiene NMI WT, mientras que con los mutantes no

26. Los resultados obtenidos son consistentes con estudios que muestran que NMI es requerido para la activación transcripcional inducida por el looping del DNA fuera del territorio nuclear. En células MCF7 se observó que luego de realizar el knockdown de NMI, la expresión de TFF1 y GREB1 podía ser restaurada cuando se expresaba el vector NMI WT, no siendo así cuando se expresaban las mutantes funcionalmente inactivas.

27. Se sabe que DLC1 interactúa directamente con el ERa unido a ligando • Analizan el efecto producido por la inactivación de DLC1 en células epiteliales mamarias, mediante la microinyección de siRNA o Ab anti-DLC1 Rol de la cadena liviana de dineina-1 (DLC1) Ambos tratamientos impiden que se produzca la interacción TFF1:GREB1

28. Al realizar una RT-qPCR se observó que se inhibe la expresión inducida por E2 de TFF1 y GREB1, pero no se afecta la expresión de genes constitutivos: MCF7 Resultados similares se obtuvieron cuando las células fueron microinyectadas con siRNA contra el factor remodelador de la cromatina BAF53. Esto es consistente con el hecho de que la acción coordinada de estos factores permite la interacción entre cromosomas

29. ChIP: análisis de la unión de ER, Pol II y CBP al promotor de TFF1, en células MCF7 Cuando se bloquean DLC1 o NMI, utilizando siRNA, no se produce un reclutamiento aberrante de ERa, o sus coactivadores. Los componentes del sistema motor nuclear actúan luego de que se produce: la unión de ERa y los eventos de reclutamiento de los coactivadores.

30. Control: Knockdown producido por siRNA. Los experimentos se realizaron en células MC7 inducidas con E2 transfectadas con siRNA. Los transcriptos fueron cuantificados mediante una real time RT-PCR

31. Los experimentos anteriores sugieren que existe una relación entre las interacciones intercromosómicas y la activación de dichos genes… ¿La trascripción de los loci que se encuentran asociados a las zonas de interacción intercromosómicas es mayor en comparación a alelos NI? Cuantifican el volumen de la señal de los transcriptos Activación de los NI  ambos alelos son igual de competentes para la activación de la trascripción. La expresión de los genes target del ERα aumenta específicamente donde hay interacciones entre los cromosomas (efecto mas marcado en interacciones monoalelicas)

32. ¿Es en los gránulos de intercromatina (speckles) donde ocurren las interacciones intercromosómicas? 2D FISH SC35: marker speckles (IGCs) Monoalelicas bialelicas +E2: Las NI no colocalizan SC35-speckles(+) +E2:Colocalizan en dos SC35-speckles(+)

33. Como habíamos visto… las interacciones intercrom. dependen de una reorganización del núcleo y se establece por una red de acción de actina/miosina LA: bloquea la polimerización de actina JP: bloquea la despolimerización de actina  No hay colocalizacion + E2 + SC35 + LA/JP

34. siDLC1 / siBAF53  No colocalizan, no hay relación entre las interacciones intercromosómicas y la activación los genes asociados a ellas. Estos resultados sugieren que los speckles funcionarían como la base para la formación de una red de activación de los genes en el núcleo.

35. Vimos que siLSD1 bloquean la trascripción E2 dependiente de TFF1/GREB1 loci pero no las interacciones intercromosomales: ¿LSD1 tiene efectos en la unión de los loci a los speckles? 2D FISH + E2 + siLSD  no colocalizan

36. ¿LSD1 tiene efectos en la unión de los loci a los speckles? 3D FISH LSD1 es necesario para la asociación de TFF1/GREB1 loci a los speckles. +LSD1 activa enz. restaura la asociación

37. Con siLSD1 se detecta una reducción parcial del reclutamiento de los coactivadores de ERα en respuesta a E2 como CBP/p300. LSD1 regula la iniciación de la trascripción y la activación de los loci al promover la asociación de estos a los speckles.

38. Modelo propuesto para la inducción con E2 • actina/miosina/DLC1 involucrados en los movimientos de los cromosomas. • LSD1 dependiente, responsable de la interacción de los loci con los ICGs.

39. Este modelo permite una rápida asociación de los loci específicos con los gránulos de intercromatina para una mayor unión de factores de trascripción con sus cofactores. Programa de “2 pasos”  reorganización nuclear  LSD1 induce la asociación entre los loci y los speckles.