ANTICORPI MONOCLONALI

1. ANTICORPI MONOCLONALI

2. Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58 1 1 2 2 3 3 4 4 1 m 3 m 2 m 4 m Antigen Spleen cells Immunization + Myeloma B cell 1 3 Cell fusion 2 1 2 3 4 4 x 1 2 3 4 Monoclonal antibodies Antiseum Pure single Ab A mixture of all Ab If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture. Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen. If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody. Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody. Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody. After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.

3. Antibodies Polyclonal Monoclonal Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured. Secreted antibodies are collected from culture media Antibodies that are collected from sera of exposed animal recognize multiple antigenic sites of injected biochemical. recognize ONE antigenic site of injected biochemical

4. Hybridoma 1975 Kohler and Milstein Multiple myeloma (human disease) Fusions generated by Sendai virus or PEG Bence Jones proteins in urine http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif

5. Creation of monoclonal antibodies (mAb’s) 1. Hyperimmunize mouse with Ag 2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG) 3. Limiting dilution (96 wells) to fractionate fused cells in HAT media selection HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). B cells die (mortal, HGPRT-positive) Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway) Fusions live (HAT Resistant and immortal)

6. Hybridoma selection (HAT media) The de novo pathway can be inhibited using aminopterin, which inhibits the transfer of methyl groups from activated dihydrofolic acid. cells needHypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines for the salvage pathway. Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway. Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.

7. Expand in mice or expand in vitro in vitro material is less concentrated and contains bovine serum ascites fluid contain high [mAb] and minor contamination with mouse Ig

8. How to purify your MAb Affinity Purification • Or use Ag or epitope to make affinity column Monospecific antibodies http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf

9. IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI • Protein purification • Identification and isolation of cell sub-populations using fluorescence cell sorting. • Tumor detection and imaging • Tumor killing • Diagnostic reagents. • Drug Detoxification • Catalytic antibodies

10. IMMUNODIFFUSIONE

11. At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate. Technique can be used to purify specific protein from a mixture Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate Immunoprecipitation

12. Impieghi dell’immunoprecipitazione • Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni • Confrontare diversi antigeni tra loro • Stabilire la purezza di un preparato antigenico

13. Immunodiffusione • Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione. • Immunodiffusione radiale • Immunodiffusione doppia • immunoelettroforesi

15. Diagrammi di possibili Modelli di precipitazione con la doppia immuno- diffusione eseguita su un antisiero e 2 diversi preparati antigenici A: epitopi identici B:nessun epitopo in comune C:identità parziale

16. IMMUNOELETTROFORESI Separazione elettroforetica degli Ag Archi di precipitazione

17. Determinare se un paziente produce quantità troppo basse di Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze • Si può vedere se produce se produce un eccesso di alcune proteine, quali albumina, immunoglobuline

18. Immunoelettroforesi quantitativa Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazione Si otterrà una retta di taratura che può servire per determinare la concentrazione di Ag in un campione incognito

19. TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE (Presenza o assenza di gonadotropina)

20. IMMUNOFLUORESCENZA

21. Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti

22. Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione). • Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito all’eccitazione a una determinata lunghezza d’onda • La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza • I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità • Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina

23. Immunofluorescense IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction Very good rapid diagnostics

24. Citofluorimetria e fluorescenza • Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo • FACS (fluorescence-activated cell sorter) • Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser. • Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula • Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa

25. SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab

26. DIAGNOSTICA

27. ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Test antiserum Test antigen

28. Visualization of reaction

30. ELISA to test MAb production itself The dark blue spot represents a positive clone. The light blue spots are positive controls, the next two wells to the right are negative controls www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im...

31. SAGGIO ELISPOT

32. Saggio radio-immunologico • Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti anticorpali. • Ab + Ag* Ab/Ag* • Ab/Ag* + Ag Ab/Ag Ab/Ag* • E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura, % conc. Ag Marcato legato a Ab Tratto lineare Conc. Ag non marcato

33. FRAZIONI DI Ab

34. The Fab fragment contains the antigen binding site Could be cleaved out by papain digest; pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2 Often it is enough for diagnostic purposes – and it is easier to produce Anti Botulinum toxin Equine FAB fragment product made by DoD at time of Gulf War, anti-ABCDEFG Hinge region www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm

35. Single chain Fv fragments The size and specificity of the ScFv fragment may allow for attachment to cryptic sites http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif

36. IMPIEGHI COME FARMACI

38. About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test™) Fluorescence in situ hybridisation (FISH) of HER2 amplification www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm

39. Herceptin (TrastuzuMAb) anti-HER MAbs Approved! http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg

40. Problemi con la terapia basata su mAb • Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano • Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody) • Danni nell’ospite • mAb causerebbero meno problemi • (volontari cercasi??!!) • Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo

41. Anticorpi chimerici: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo • Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano

42. Anticorpi umanizzati Clone those genes and express them as a recombinant protein in the protein expression system Sales of Rituxan/ MabThera by Year http://www.sh.lsuhsc.edu/ intragrad/micro/micro297/4

43. Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani

44. Xenomouse(topo con IgH e Igk umani) Abgenix http://www.sh.lsuhsc.edu/ intragrad/micro/micro297/4

46. waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate Antibody is tumor-specific ricin from the castor bean (Ricinus communis).

47. Only the targeted tumor cells are killed by the toxin Common side effect – Vascular leak syndrome. Could be relieved by usage of mutated toxin Bunch of other toxins could be used

48. : www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm potent single chain ribosome inactivating protein Saponin (from soapwort) Goal: treatment of leukemias and lymphomas For T-cell leukemia could be targeted via CD7

49. Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer,which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells www.stjosephs-marshfield.org/ OctreoScan in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate