第十六章分子流行病学 Molecular Epidemiology 1. 概述

第十六章分子流行病学 Molecular Epidemiology 1.概述 2.研究内容 3.研究方法 4.发展与应用前景

Contents 1.Introduction 2.Research methods 3.Brief introduction to common laboratory techniques 4.Utilization of molecular epidemiology 5.Example for molecular epidemiological researches 6.Prospect (look into the future)

Section one Introduciton

一、分子流行病学的产生与发展历程 Progress of molecular epidemiology （一）背景分子生物学技术的不断发展： 1．分子流行病学的研究方法越来越多：如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化或半自动化测定，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、DNA序列分析、酶定量分析等等。 2．研究内容越来越多：已从研究传染病的病原体、传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。 3．应用范围越来越大：从预防医学到整个生命科学。

（二）发展历程 1.概念的演变：近20年来分子生物学被引入流行病学研究领域。使流行病学研究中的组间比较更为准确；对发病机制的认识更为明确；对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重要组成部分。

最早使用“分子流行病学”这一术语的是Kilboure，最早使用“分子流行病学”这一术语的是Kilboure，他于 1972年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。但作者并未解释“分子流行病学”的涵义。之后有关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。

1993年Schulte出版了第一部分子流行病学专著，并给分子流行病学定义为，“在流行病学研究中，应用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环节。”

2.血清流行病学定义 血清流行病学(seroepidemiology)是应用血清学方法检测人群中特异性抗原、抗体、各种代谢产物、遗传标记、生化指标、营养成分等血液成分，借以了解疾病或健康状况在人群中的分布及其影响因素，探讨疾病发生的原因并评价预防措施的效果。血清流行病学是流行病学的一个重要分支之一。

血清流行病学有狭义和广义之分。 而广义上的血清流行病学实际上由于分子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流行病学之中，实际上已属于分子流行病学的研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于读者对分子流行病学的理解。

二、分子流行病学的定义 Definition and progresses of molecular epidemiology （一）分子流行病学的概念 Definition of molecular epidemiology 分子流行病学(molecular epidemiology)是应用分子生物学的基本理论和技术，研究疾病或健康的人群现象。它从分子水平揭示影响疾病或健康分布的因素，为更有效地控制疾病和促进健康提供基因或分子水平的研究方法和防治手段。

Molecular epidemiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology. What defines molecular epidemiology, as opposed to conventional epidemiology, is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the propensity of developing a disease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease.

Molecular epidemiology has the same objectives as conventional epidemiology: to study the occurrence, development and prognosis of disease, to evaluate the effectiveness of preventive and therapeutic interventions, and to provide essential evidence for clinical and healthcare decision making.

三、与传统流行病学的关系 Relationship between conventional and molecular epidemiology 分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子”之谜。

Conventional EpidemiologyExposure DiseaseMolecular Epidemiology

暴露标志疾病标志暴露 内剂量生物学早期生物结构和临床疾病预后意义效应剂量学效应功能改变易感性标志传统流行病学与分子流行病学的关系

Section two Research Content

一、生物标志 • 种类 • 暴露生物标志(exposure biomarker) • 定义与疾病/健康状态有关的暴露因素的生物标志 • ①外暴露标志(external exposure marker , EEM ) • ②内暴露标志(internal exposure marker , IEM) • ③生物作用标志(biologically active marker, BAM)

效应生物标志(effect biomarker) • 定义指宿主暴露后产生功能或结构性改变的生物标志 • 早期生物效应标志(early biological effect marker, EBEM) • 结构和功能改变标志(altered structure and function marker, ASFM) • 病理标志(pathological marker, PM) • 临床疾病标志(clinical disease marker, CDM) • 健康状态标志(health condition marker, HCM)

易感性生物标志(susceptibility biomarker) • 定义　指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志 • 易感性与宿主的遗传特征、生长发育、营养等有关。 • 　　宿主在不同疾病阶段，可以具有不同的易感性标志。

生物标志选定 • 生物标志的筛选 • ①研究目的 • ②候选生物标志特征的意义 • ③检测方法的有效性

生物标志特性 • ①分子特性 ②时相特性 • ③个体内变异 ④个体间变异 • ⑤群体间变异 ⑥储存变异

检测方法 • ①实用性 • ②可信性 • ③有效性灵敏度、特异度

常用的生物标志 • 传染病生物标志表16-1 传染病研究常用的生物标志

慢性非传染病的生物标志 表16-2 慢性非传染性疾病常用的生物标志

二、暴露测量 • 外暴露研究 • 检测鉴定生物性病原因子流感嗜血杆菌 • 研究病原生物进化变异规律 o157大肠杆菌 • 确定传播途径 S.munchen菌感染 • 测量非生物性因素暴露吸烟烟雾

内暴露研究 • 传染性疾病 • ①人体感染状况 • ②追踪传染源 • 慢性非传染病 • ①内暴露水平 • ②生物作用水平

三、效应测量 • 传染病 • 慢性非传染病 • 健康状态 • 免疫效应 • 病理性效应 • 基因表达和代谢异常 • 基因突变或染色体畸变

四、易感性测量 遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志慢性非传染病载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同传染病不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大

五、疾病防治效果评价 • 传染病 • 预防接种效果评价 • 预防接种相关疾病研究 • 慢性非传染病 • 潜隐期长 • 多影响因素

Section three Research methods

一、生物标志的确定与标本采集 Determination of biomarkers and collection of specimens （一）生物标志的确定(determination of biomarkers) 生物标志(biomarker)分为三大类，即暴露标志(exposure marker)、效应标志(effect marker)和易感标志(susceptibility marker)。这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密切相关连的具体标志。

1.暴露标志的选择(selection of exposure markers) 应选择那些最具代表暴露剂量而又十分客观、稳定、敏感、特异的标志。暴露标志是指那些与疾病或健康有关的暴露因素的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。外暴露标志(external exposure marker)：暴露因素进入机体之前的标志，如病毒、细菌、支原体等微生物及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。内暴露标志(internal exposure marker) ：暴露因素进入机体之后的标志。

2.效应标志的选择(selection of effect markers) 机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期间，会产生与之相对应的生物学效应(biological effect)或称为生物学反应 (biological response)。因此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发生变异的基因、产生的特异性产物等。应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。

3.易感标志的选择(Selection of susceptibility marker) 易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和易感基因作为易感测定标志。

（二）标本的采集(Collection of specimens) 标本的采集、运送和储存是实验室分析的第一步，也是很关键的一步。为了采集高质量的标本，应注意以下几个问题：

1.采集最适标本(Collection of optimal specimens) 首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集何种标本。可以从以下几个方面考虑取材部位： ①从病原体入侵部位取材； ②从病原体感染的靶器官取材； ③根据病原体的排泄途径取材； ④非传染性疾病主要从受损组织取材或其它能反映效应指标的标本； ⑤直接采集病原标本。此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要在早期和晚期采集标本。

常采集的标本有： 病原体标本；体液标本，如血液、尿液、胃液、精液、分泌物等；组织标本，如机体各种组织、毛发、媒介体等。

2.标本的运送与储存(Transport and storage of specimens) 标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好，如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取冷冻、冷藏运输，以保持活性。采集的标本应放入适当的容器，以不易损坏和泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派专人专车运送。采集的标本除了防止扩散，也应防止被污染包括生物性的、化学的或其它标本的污染。采集的标本储存后应不影响检测结果，即在任何时间检测都可获得一致的结果。所有的标本都应有详细的记录和标签等。

二、常用实验室方法(Common lab methods) （一）核酸研究方法(Research methods of nucleic acid) 随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其本身的遗传物质 —— 核酸（DNA或RNA）所决定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物现象（效应）的本质。

1.核酸中碱基含量的测定(Assay of basyl content in nucleic acid) 常用的是G+C含量的测定。亲缘关系近的病原体，它们的G+C含量相同或近似，亲缘关系远的病原体，它们的含量不同。因此，可用于传染病传染源和传播途径的分析。但在某些情况下，G+C含量相同或近似的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核苷酸序列。

2.核酸电泳和限制性内切酶图谱分析(Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysis) 某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带具有特定的数目和大小、分布特征等。其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病原体或生物标本产生不同电泳图谱。

图2 T-A克隆后酶切鉴定结果Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23strain

3.核酸杂交(nucleic acid hybridyzation) 核酸杂交需要一个探针(probe)，即一种标有示踪分子的特异单链 DNA 或 RNA分子，这种探针可与待测标本中的特异性序列结合。常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列的检测。常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交等方法。

4.寡核苷酸指纹图(oligonucleotide finger printing) 病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，显示出一定的图谱特征，称为指纹图 (finger printing)。此图谱具有特异性。常用于微生物同源性分析。

5.质粒图谱分析(plasmid figure analysis) 不同的细菌的质粒DNA不同，因此可对质粒DNA进行酶切反应、电泳、图谱分析。常用于微生物同源性分析。

6. PCR(polymerase chain reaction) PCR是一种80年代初发展起来的一种高效体外基因DNA扩增技术，需要一对寡核苷酸引物（上游和下游各一），在耐热的DNA多聚酶的作用下，合成特异的DNA序列，包括高温变性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万倍。此法具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核苷酸序列检测等。

7. DNA序列分析(DNA sequencing) DNA序列分析有了很大的发展，常用双脱氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、快速、准确、可靠。该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一种方法，可用于任何来源的两个或多个DNA片段之间核苷酸序列的比较。所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。

8.单链构象多态性分析 ( single-stranded conformation polymorphism,SSCP) 是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。此法可以检测基因突变。但不能确定基因变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。 SSCP可用于病原体和生物标本的研究。

9.基因定点突变技术 (Site-directed mutagenesis) 此技术可随意在克隆的基因上进行突变，然后测量突变后基因功能的改变。常用于基因结构与功能的研究。

（二）蛋白质研究方法(Research methods of proteins) 只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因进行分析，因为蛋白质的氨基酸（aa）顺序是由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分析也具有特异性。蛋白质技术包括PAGE、肽图分析(peptide mapping)、转印技术、色谱技术、测序技术等。

第十六章分子流行病学 Molecular Epidemiology 1. 概述