Blood Group reagent evaluation

1. Blood Group reagent evaluation Dr.Atoosa Shariat Torbaghani Reference Health Laboratory

2. Universal precautions • HIV • HBV

3. Appearance • NO……. • hemolysis • Precipitate • Particle • Gel-formation • ………………… in inspection

4. Contamination • Culture • must be negative • Using validate process to produce • Preservative • Sterile filter

5. Anti A & B potency Testing • Prepare new saline contain 1-2% albumin • Two fold dilution of reagent with saline- one tube neg after it( 1/512) • Wash cells -at least twice • 2% suspension RBC with saline(A cell & B cell) • 0.1 ml serum dilution+0.1ml RBC (10*75 mm tube) • Shake gently • Incubate 5 min at RT(20-30c) • Centrifuge (15 sec /1000 g ) • and grade (1+ to 4+) • The greatest dilution which gives 1+ agglutination(small clumps macroscopically)

6. Anti A & B Acceptable 1/128 A1 , B , A 1B 1/64  A 2 B , A 2 Or = Reference Reagent

7. بررسی Potency • برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/1 ...... ادامه داد. • برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود. • لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید • تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید • تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید • برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید. • جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

8. تهیه سوسپانسیون گلبول قرمز • در صورت استفاده از سلول منجمد ، روش کار دقیقی برای فریز کردن و ذخیره کردن و آب کردن و مصرف مجدد آن، تهیه گردد.همچنین بعد از آب شدن ، روشی برای کنترل کیفیت سلولهای قرمز تدوین گردد. • گلبولهای قرمز را حداقل دو بار با سالین شستشو دهید.( تا حدی که مایع رویی شفاف گردد) • سوسپانسیون 2% از سلول pack شده با سالین حاوی 2-1% آلبومین تهیه کنید.

9. حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد *سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد **سلول A2 یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد

10. روش انجام کار برای بررسی potency • 1 میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد • 0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید • محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 5 دقیقه در حرارت اطاق ( 30-20 درجه سانتیگراد) انکوبه کرده سپس با دور rpm 1000(100-125 rcf) به مدت یک دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 15 ثانیه (900-1000 rcf ) سانتریفوژ کنید

11. نحوه تفسیر نتایج • سلول ته لوله را به آرامی تکان دهید تا جدا شود و ماکروسکوپی بررسی نمائید. • واکنش را به روش زیر درجه بندی نمائید: • +4 توده سلولی به صورت یک تکه باقی بماند. • +3 توده سلولی به چند قطعه بزرگ خرد شود • +2 توده سلولی به چندین قطعه کوچک مساوی خرد شود • +1 توده سلولی به ذرات ریز قابل مشاهده خرد شود • .D توده سلولی به ذرات ریز غیر قابل مشخص خرد شده است. برای درجه بندی این آزما یش خاص بهتر است موارد مشکوک را منفی گزارش کنید. • واکنش منفی به مواردی اطلاق میشود که توده سلولی طوری باز شود که کلامپ سلولی دیده نشود • آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود • رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد • لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود.

12. ارزش تیتر بدست آمده • آنتی سرم های ABO حد اقل تیتری مساوی تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

13. FDA & WHO • برای anti-A از استاندارد 03/188 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد • برای anti-B از استاندارد 03/164 با رقت 1/4 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

14. Anti A & B Avidity(BOB) • 10% saline suspension of A&B cell (once washed) • 100λ cell+100λ serum(slide area 25mm) • Time record beginning agglutination(T<25˚C) Serum Cell beginning time(seconds) Anti-A A1 15 A2 30 A1B 30 A2B 45 Anti-B B 15 Macroscopic clump(1mm2) before 3 minutes

15. بررسی Avidity • رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید • گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

16. حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد • *سلول A2B یعنی سلول AB که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد • **سلول A2 یعنی سلول A که با anti-A1 و anti-H واکنش ندهد • *** سلول Ax یعنی سلول variant A در صورتیکه سازنده توصیه کرده آنتی سرمش با سلول A ضعیف هم واکنش دارد

17. انجام آزمایش • آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید. • نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید.

18. نتایج آزمایش : • نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود. • آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد

19. Anti A & B Specificity • Confirm reaction with A,B,AB At least 2+ reaction B. Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا

20. آزمایش Specificity • نباید آنتی سرم را رقیق کرد • حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد • آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن • آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها

21. تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن • حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود • برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود • در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتیژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

22. حداقل سلولهائی که برای آزمایش specificity لازم میباشد

23. تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها • آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید: • A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw • در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد: • A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb • حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شده و آزمایش مستقیم انجام شود.

24. نحوه تفسیر نتایج specificity • در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود. • برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید. • مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند

25. Anti-A & B False Agglutination(BOB) • 10% saline suspension of cell Rh+(once washed with 0.15 M saline& Unwashed) • 100λ cell +100λ serum • Mix two minutes (room temperature) • or(slide area 1×3 in.) • No agglutination, hemolysis, rouleaus formation

26. آزمایش از نظر آگلوتیناسیون خود به خود • رقتهای آنتی سرم: • نیازی به رقیق سازی نمی باشد • آنتی سرم با سلول O منفی نباید واکنش آگلوتیناسیون ایجاد نماید • (سلول O منفی حاوی آنتی ژن c که توسط آنتی بادی Anti-c از نوع IgG پوشیده شده)

27. package & container • Container • Color of label paper • Information • Lettering size • Visual inspection • Package label

28. stability control • Minimum of 1% of each batch • Should be retained at least 6 months beyond expiry date

29. روش پیشنهادی مرکز ملی خون صلیب سرخ تایلند

30. ارزيابي آنتي سرم گروه خوني Anti-Rh

31. Universal precautions • HIV • HBV

32. Appearance • NO……. • hemolysis • Precipitate • Particle • Gel-formation • ………………… in inspection

33. Contamination • Culture • must be negative • Using validate process to produce • Preservative • Sterile filter

34. Anti-Rh(FDA) Titration • Serial two fold dilution (anti-Rh) • 2% suspension cell Rh+ • 100 anti-Rh + 100 cell • Incubation(One hour 37c) • Centrifuge(45 sec at 1000 g) • Reading & grading 1+ > 1/16(FDA) , 1/32(BOB) Or = reference

35. Anti-Rh(BOB) Titer • Two fold dilution serum in 20% albumin • “ “ “ “ salin • 2% suspension RBC(Rh2) with albumin • “ “ “ salin • 0.1 ml serum dilution+0.1 ml RBC • Incubate 37°C for 60 minutes • Centrifuge (2 minures at 1000 rpm) [a control  albumin+RBC “  erum dilution + RBC Rh negative] • Observe for agglutination 1+ > 1/32

36. بررسی Potency • برای رقیق سازی باید از لوله ای شروع کرد که آنتی سرم رقیق نشده و سپس با رقیق سازی 12/1 ، 4/1 ، 8/1 ...... ادامه داد. • برای رقیق سازی، از سالین ایزوتونیک حاوی آلبومین 2-1 % استفاده شود. • لوله آزمایش75 mm 12× یا بزرگتر به کار برید • تیتراسیون را تا جائی که به نتیجه منفی برسید ادامه دهید • تیتراسیون را با آنتی سرم رفرانس به طور همزمان ، مطابق روشی یکسان انجام دهید • برای جلوگیری از carry over بهتر است سر سمپلرها را برای هر رقت ، تعویض نمائید. • جهت کنترل ایزوتون ، آخرین لوله را با ایزوتون بدون آنتی سرم پر نمائید.

37. حداقل سلولهائی که برای آزمایش potency لازم میباشد

38. روش انجام کار برای بررسی potency • میلی لیتر از معرف آنتی سرم را در لوله آزمایش ریخته و رقت سریال تهیه کنید طوری که در هر لوله آزمایش 0.1 میلی لیتر آنتی سرم باشد • میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی ( محلول 2% گلبول قرمز که با ایزوتون حاوی 2% آلبومین تهیه شده) را به هر لوله اضافه کنید • محتویات لوله ها را به خوبی مخلوط کنید. 15 دقیقه در حرارت 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید • سپس با دور rpm 1000(100-125 rcf) به مدت دو دقیقه و یا 3400 rpm به مدت 45 ثانیه (900-1000 rcf ) سانتریفوژ کنید .

39. آخرین لوله ای که واکنش +1 دارد به عنوان تیتر potency در نظر گرفته شود • رقیق سازی تا حداقل ، یک لوله بعد از endpoint ادامه داشته باشد • لوله آنتی سرم بدون سلول باید منفی شود. • آنتی سرم های Rh حد اقل تیتری مساوی تیتر آنتی سرم رفرانس داشته باشد

40. FDA & WHO • برای low protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/3 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد • برای high protein anti-D از استاندارد 99/836 با رقت 1/8 که توسط سالین حاوی آلبومین 2% میباشد

41. Anti Rh Specificity • Confirm reaction with A,B,AB At least 2+ reaction B. Confirm absence of reaction with panel cell due to Ab contamination D,C,E,c,e,cw,k,R,Kpa,Kpb,Fy,Fyb,Lub,Lua,JKa,JKb,M,N,S,s,PI,Xgaا

42. آزمایش Specificity: • نباید آنتی سرم را رقیق کرد • حد اکثر 7 روز از زمان خونگیری گذشته باشد • آزمایش تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن • آزمایش جهت تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها • آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B

43. تایید واکنش با سلولهای دارای آنتی ژن • حداقل از 4 اهداکننده ، خون جمع آوری شود • به عنوان مثال برای بررسی anti-CDE حداقل 4 اهدا کننده برای جزئ anti-C و 4 خون برای anti-D و 4 خون برای anti-E به کار رود. • برای هر آنتی سرم به طور جداگانه سلول تهیه شود • در هر سری کاری حد اقل یک سلول قرمز فاقد آنتی ژن مربوطه، به عنوان کنترل منفی آزمایش شود.

44. تائید عدم آ لودگی با سایر آنتی بادیها • آنتی سرم را با سلول های زیر مجاور کرده و آزمایش کنید: • A, B, H, Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb ,Pi , D , C , E , c , e , Cw , M , N , S , s , U , Lua , Lub , JKa , JKb , Fya , Fyb , Xga , Doa , Dob , Yta , Ytb , Lan , Coa , Cob , Mg , Wra , Sda ,Vw • در صورتی که آنتی سرم منوکلونال بوده و این کلون قبلاً بررسی و تائید شده میتوان فهرست فوق را خلاصه تر کرد: • A , B , H , Lea, Leb , I , K, k , Kpa , Kpb , Jsb, Pi , D , C , E , c , e , M , N , S , s , U , Lub, JKa , JKb , Fya , Fyb

45. آزمایش جهت تائید عدم حضور anti-A , anti-B • از گلبولهای قرمز حاوی آنتی ژن A1 و B که فاقد آنتی ژنهای D باشد استفاده کنید. • ( از گلبول A1B می توان نیز استفاده کرد. )

46. نحوه تفسیر نتایجspecificity • در هیچیک از واکنشها نباید همولیز و یا رولو دیده شود. • برای تائید حضور آنتی ژن ، واکنشهای مثبت باید حداقل 2 + باشد.اگر یکی از 4 خون مورد آزمایش ، واکنش کمتر از 2+ داشته باشد باید 4 خون دیگر را آزمایش کنید.در صورتیکه فقط یکی از این 8 آزمایش دارای واکنش کمتر از 2+ داشته باشد ، نتیجه را قابل قبول بشناسید. • کنترل منفی ، باید واکنش منفی نشان دهد. • مواردی که عدم حضور آنتی ژنها را بررسی میکنیم باید واکنشها منفی باشند.

47. Anti-Rh Avidity (BOB) • 40% suspension RBC RH positive in their own plasma or serum, or in AB plasma or serum • 100λ cell + 50 λ serum (slide area 20*40) • Place on illuminated glass ( T<47 °C) • The end of 2 minutes record size of clump Beginning before 60 seconds Clump at least 1mm/2 min RBC Dce(Rh1) / Dce(Rh0) / DcE(Rh2)

48. بررسی Avidity • رقت 2/1 را با مخلوط کردن مقادیر مساوی آنتی سرم مورد آزمایش و سرم AB که فاقد آنتی بادی میباشد و یا با هر رقیق کننده ای که سازنده توصیه کند ، تهیه کنید • گلبول قرمز را سازنده ، مطابق روشهای خود تهیه کند

49. حداقل سلولهائی که برای آزمایش Avidity لازم میباشد:

50. انجام آزمایش: • آزمایش را با آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده به روش اسلاید انجام دهید. • نتیجه آزمایش را در زمان ادعا شده توسط سازنده و همچنین در نصف زمان فوق ، یادداشت کنید • نشانه های آگلوتیناسیون، در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده درپایان نیمه اول زمان واکنش ( که توسط سازنده ادعا شده بود )باید مشاهده شود. • آگلوتیناسیون واضح ،در هر دو آنتی سرم رقیق شده و رقیق نشده، درپایان زمان واکنش ، به صورت توده کمتر و یا بزرگتر از یک میلیمتر گزارش گردد.